抑制KLF4表达对乳腺癌细胞MCF7恶性表型的影响

摘要

在过去20年间全世界乳腺癌发病率几乎翻了一番。现今全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,有50万妇女死于乳腺癌。WHO报告,在西方发达国家,乳腺癌已超越其他肿瘤,成为20-59岁女性的首要死因。中国目前的发病率虽然不如西方国家高,但在过去30年中,乳腺癌是上升最快的恶性肿瘤之一,仅次于肺癌,严重威胁我国妇女的身心健康!
　　 随着对生物学标志物的不断深入研究,乳腺癌的诊断和个体化治疗水平逐步提高,为其他肿瘤的诊治提供了很好的借鉴。ER、PR、HER-2等分子标志物的发现以及深入的研究与开发,使得现在的乳腺癌治疗手段拓展到了内分泌治疗、分子靶向治疗领域,进一步寻找更多、更好的分子或基因治疗靶标则成为了目前非常重要的热点之一。
　　 转录因子(transcription factor)是一群能与基因5’端上有特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。因而其表达的变化会导致目的基因及目的蛋白的表达失常,并可能对肿瘤的发生、生长、侵袭及转移等起作用。
　　 人类Krüppel样因子4(KLF4)作为新发现的转录因子,因为在诱导小鼠成纤维细胞生成iPS细胞中的重要地位而受到重视,它通过激活或抑制其目标基因的转录来调控目标基因在细胞和组织中的表达,以及与细胞时相相关的动态性表达,从而调控众多细胞生理活动,如细胞生长、增殖、分化及凋亡等。研究发现KLF4在原发性乳腺癌组织中表达升高,且其核内KLF4的高表达意味着乳腺癌恶性度高,预后差。使得KLF4在乳腺癌的发生、发展以及治疗、判断预后等方面的研究逐渐铺开。
　　 本研究以KLF4为研究对象,以筛选出的天然高表达KLF4的人乳腺癌细胞MCF7为模型,采用人工siRNA(小干扰RNA)转染技术对KLF4表达进行抑制,初步研究抑制KLF4对乳腺癌细胞MCF7的生长、克隆形成能力等恶性表型的影响。具体内容如下:
　　 1.筛选KLF4高表达的乳腺癌细胞株:
　　 1.1培养人乳腺癌细胞株:MCF7、Bcap37、MDA231、T47D、SK-BR3；并培养天然低表达KLF4的人肺癌细胞株H322,及稳定转染KLF4的细胞株H322／KLF4分别作为阴性和阳性对照。
　　 1.2检测各细胞株的KLF4在蛋白水平和RNA水平的表达情况,筛选出在RNA和蛋白水平均天然高表达KLF4的MCF7细胞作为后续实验模型。
　　 2.以KLF4-siRNA敲低MCF7细胞的KLF4表达:利用Oligofectamine Reagent将KLF4-siRNA转染人乳腺癌细胞MCF7,获得KLF4敲低的MCF7细胞；同样转染control-siRNA至MCF7细胞。分别提取RNA,以RT-PCR法检测KLF4的表达。
　　 3.以MTT法检测KLF4表达抑制对MCF7细胞在体外生长能力的影响:
　　 将KLF4-siRNA转染的MCF7细胞作为敲低组(MCF7／KLF4-siRNA),control-siRNA转染的MCF7细胞作为对照组(MCF7／control-siRNA),分别接种于96孔板,培养1,3,5天,分别加MTT孵育,用DMSO溶解结晶,在570 nm处读取吸光度值,绘制生长曲线。结果显示,KLF4敲低的细胞与对照组相比,生长呈明显减慢的趋势,有显著差异(P<0.01)。
　　 4.克隆形成试验观察KLF4表达抑制对MCF7细胞克隆形成能力的影响:
　　 将转染好的MCF7／KLF4-siRNA和MCF7／control-siRNA细胞株分别接种于6孔板,培养14天,加入龙胆紫染色后观察比较两组的克隆形成数,结果显示,KLF4敲低的细胞与对照组相比,克隆形成能力减弱,有显著差异(p<0.01)。
　　 通过本课题的研究,得到以下初步结论:
　　 1、人乳腺癌细胞株MCF7是KLF4天然高表达的细胞；
　　 2、KLF4表达抑制能显著减缓MCF7细胞的生长；
　　 3、KLF4表达抑制能显著减弱MCF7细胞的克隆形成能力。