冷鲜猪肉中主要病原菌检测及单增李斯特菌的生长预测模型比较

摘要

食品安全问题已成为我国乃至全世界关注的热点问题之一，而其中病原微生物在诸多影响食品安全的危害中位居第一，给人类健康带来严重危害。本研究旨在：(1)优化沙门氏菌及大肠杆菌O157∶H7的检测方法；(2)初步探明生猪肉制品中，特别是冷鲜猪肉中单增李斯特菌、沙门氏菌及大肠杆菌O157∶H7的污染状况；(3)分析低温下(4-16℃)冷鲜猪肉中单增李斯特菌的生长状况，并对现有微生物预测软件-PMP(Pathogen Modeling Programme)、GP(Growth Predictor)和CP(Combase Predictor)的预测能力进行比较。
　　 本研究对文献中报道的沙门氏菌属的5套PCR体系(可同时区分鼠伤寒沙门氏菌及肠炎沙门氏菌)的特异性和保守性分别进行了比较分析，筛选出一套最优体系，即基于属特异性基因ompC(外膜蛋白C)、鼠伤寒沙门氏菌特异性基因spv(沙门氏菌质粒毒力基因)及肠炎沙门氏菌特异性基因Sdfl(与侵袭和感染相关的染色体区域)，可分别扩增出大小为204bp、401bp及304bp的三条带。本研究利用高纯度DNA提取试剂盒制备沙门氏菌的基因组模板。该体系可准确检测到浓度分别为5.65pg/μL、3.91pg/μL及3.51pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及其他血清型沙门氏菌(纽波特沙门氏菌)的基因组DNA。
　　 比较分析了大肠杆菌O157∶H76套PCR鉴定体系。其中最优体系基于rfbE(O157抗原基因)及.fliC(H7抗原基因)可分别扩增出大小为291bp及625bp的两条带。该体系对样品24h增菌液进行检测，可准确检测到对应原25g样品中18CFU的大肠杆菌O157∶H7。因此，在实际检测中可直接对增菌液进行PCR鉴定，如为阴性结果即停止后面的细菌分离，从而大大减少了人力物力。
　　 基于这两套体系以及本实验室已建立的单增李斯特菌特异性检测方法，我们对杭州市场上采集的50份常温鲜猪肉及150份冷鲜猪肉中单增李斯特菌、沙门氏菌及大肠杆菌O157∶H7的污染状况进行了调查。结果显示，200份样品中致病菌总检出率为21％，冷鲜猪肉中的致病菌检出率(24.7％)明显高于常温鲜猪肉(10％)。单增李斯特菌在常温鲜猪肉中的检出率为2％，而在冷鲜猪肉中达14.7％；沙门氏菌在冷鲜猪肉中的检出率(11.3％)亦高于常温鲜猪肉(8.0％)；大肠杆菌O157∶H7均未检出。在检出的沙门氏菌中，4株为鼠伤寒沙门氏菌，均来自于冷鲜猪肉。本研究提示，目前市场上，冷鲜猪肉存在病原微生物污染的安全隐患，这可能是由于其较为复杂的生产流通环节受到污染所致。
　　 另外，我们测定了低温下(4-16℃)单增李斯特菌在冷鲜猪肉中的生长特性，并用DMFit软件对生长数据进行拟合，计算相应的的迟滞期(Lag phase duration，LPD)、生长率(Growth rate，GR)、最大生长密度(Maximum population density，MPD)，同时用三种预测模型对相同条件下单增李斯特菌在猪肉中的生长进行预测，将实测值与预测值进行比较分析。结果显示，在16℃冷鲜猪肉中时，经过2.6h单增李斯特菌即可进入对数生长期。从8℃提高至12℃时，单增李斯特菌在冷鲜猪肉中的生长率增长一倍多(从0.017log(cfu/g).h-1增至0.038log(cfu/g).h-1)。在4℃-16℃，PMP预测的GR要比实测值低，而LPD则高于实测值。8℃以上时，CP对LPD的预测与实测值接近，而其预测GR要低于实测值；GP预测的LPD及GR皆高于实测值。因此，在冷却肉生产中严格控制温度尤为重要。由于PMP较为保守却不安全的预测，在对冷鲜猪肉中单增李斯特菌生长进行预测时不提倡采用此种模型，而建议用GP对LPD进行预测、CP对GR进行预测，以提供更合理的风险评估数据。