过氧化氢作为信号分子在小麦耐铝性中的作用及机理

摘要

全世界大约30％的土地面积和50％的潜在可耕地属于pH低于5.5的酸性土壤。我国的酸性土壤主要分布在南方14个省区，约占耕地面积的21％。铝毒被认为是酸性土壤中限制作物生长最主要的障碍因子。业已证明，铝虽非过渡金属元素，不能催化氧化还原反应，但是它可通过形成铝超氧化物半还原态自由基(aluminum superoxide semireduced radical ion)而具有过氧化活性，常诱导植物细胞过量产生引起氧化胁迫的各种活性氧(ROS)，如超氧自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH)和单线态氧(1O2)等。在各种活性氧中，H2O2在逆境胁迫下植物体内的产生及其生理功能在近些年引起了人们的关注。H2O2一直被认为是植物有氧代谢的有毒副产物，能引起植物体内蛋白质、脂类和DNA等大分子物质的氧化损伤。然而，近年来的研究表明，H2O2具有双重作用，高浓度时引起细胞死亡；低浓度时起到信号分子作用，触发植物对各种非生物和生物胁迫的抗性。但是，关于铝胁迫下植物根系H2O2的产生、调控机理及其与耐铝性的关系等方面的报道较少，许多问题尚不完全清楚。本研究以不同耐铝性的2个小麦基因型(扬麦5号，敏感基因型；鉴-864，耐铝基因型)为材料，针对铝胁迫下小麦根系H2O2的代谢规律及其与耐铝性的关系、铝胁迫下根系中铝和H2O2的分布特征及其与耐铝性的关系、H2O2预处理对根系H2O2代谢的影响及其与小麦对铝毒胁迫反应的关系、铝胁迫下根系H2O2的来源与调控机理、铝胁迫下H2O2介导的体内信号转导过程等方面进行研究，以期探明H2O2作为信号分子在小麦耐铝性中的作用及其机理，为进一步揭示植物铝毒和耐铝机理以及耐铝性状的遗传改良提供理论依据。取得的主要结果如下：
　　 (1)采用水培试验，研究了不同铝浓度(10，20，30，40，50μM AlCl3)和30μM AlCl3下不同时间(3，6，12，24 h)对扬麦5号和鉴-864根系伸长、根尖丙二醛(malondialdehyde，MDA)和ROS含量、Evans blue吸收量以及抗氧化活性的影响。结果表明，根尖铝含量和根系伸长受抑程度随着铝浓度的提高和铝处理时间的延长而增加，但扬麦5号显著高于鉴-864。30μM铝处理下，2个基因型根尖H2O2和O2-含量、MDA含量、Evans blue吸收量均显著升高，且扬麦5号高于鉴-864。铝胁迫下2个基因型根尖的抗氧化酶(SOD、POD、CAT、APX、MDHAR、GR和GPX)活性、抗氧化剂(AsA、GSH)含量以及表征总抗氧化活性的总抗氧化能力(FRAP)和自由基清除率(DPPH)也随着铝处理时间延长而逐渐升高，但是扬麦5号根尖SOD和POD活性均显著高于鉴-864，而CAT、APX、MDHAR、GR、GPX活性和AsA、GSH含量以及FRAP和DPPH均显著低于鉴-864。表明，铝胁迫诱导小麦根尖H2O2积累，导致氧化胁迫是根系伸长受抑的主要原因，具有较高的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量以及抗氧化活性是耐铝基因型根系伸长受铝抑制程度较轻的重要原因。
　　 (2)采用水培试验，研究了30μM AlCl3处理下扬麦5号和鉴-864根系不同部位中铝、H2O2以及酶和非酶抗氧化活性的空间分布特征及其与耐铝性的关系。结果表明，铝胁迫下2个基因型小麦距根尖0-25 mm根段中Al含量、H2O2和O2-含量、MDA含量、Evans blue吸收量以及抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性和抗氧化剂(AsA、GSH)含量均显著升高，且扬麦5号显著高于鉴-864。在距根尖0-25 mm根段中，0-5 mm根段的伸长受抑最为严重，Al、H2O2和MDA含量以及Evans blue吸收量最高，而O2-含量以5-10 mm最高。铝胁迫下2个基因型距根尖0-25 mm根段的抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性和抗氧化剂(AsA、GSH)含量也显著升高，但扬麦5号的SOD和POD活性显著高于鉴-864，而CAT和APX活性以及AsA和GSH含量均显著低于鉴-864，且距根尖0-5 mm根段的抗氧化酶活性和非酶抗氧化剂含量最高。表明，铝胁迫下小麦根系中铝和活性氧的积累和抗氧化响应具有明显的空间变异，距根尖0-5 mm区域是铝和活性氧积累的主要部位，对铝胁迫最为敏感。铝诱导小麦距根尖0-5 mm根区的H2O2积累和由此造成的氧化胁迫是根系伸长受抑的主要原因，距根尖0-5 mm根区的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量较高是耐铝基因型根系伸长受抑程度较轻的重要原因。
　　 (3)采用水培试验，研究了0.6 mM H2O2预处理2 h对2个小麦基因型铝毒的缓解作用及其机理。结果表明，30μM铝处理24 h后，2个基因型根尖H2O2和O2-含量、MDA含量、Evans blue吸收量均显著升高，且扬麦5号高于鉴-864。H2O2预处理显著缓解铝对根系伸长的抑制，降低根尖H2O2、O2-和MDA含量和Evans blue吸收量，且扬麦5号中缓解效果显著高于鉴-864。此外，H2O2预处理进一步提高铝胁迫下2个基因型根尖SOD、CAT、POD、APX、MDHAR、GR和GPX活性和AsA和GSH含量以及表征总抗氧化活性的总抗氧化能力(FRAP法)和自由基清除率(DPPH)，且扬麦5号的增幅均显著大于鉴-864。表明，H2O2预处理主要是通过提高小麦根尖的抗氧化酶活性和非酶抗氧化剂水平，增强根尖的抗氧化活性，减轻铝胁迫诱导ROS的积累所造成的氧化损伤，从而缓解铝对小麦的毒害作用，且对敏感基因型的缓解效应更为明显。
　　 (4)采用H2O2产生相关的酶抑制剂和H2O2清除剂，研究了铝胁迫下2个小麦基因型根尖H2O2产生和积累的来源。结果表明，30μM铝处理下2个基因型根尖H2O2含量、MDA含量、Evans blue吸收量均显著升高，且扬麦5号高于鉴-864。H2O2清除剂DMTU、NADPH氧化酶抑制剂DPI、SOD抑制剂DDC、过氧化物酶抑制剂NaN3和多胺氧化酶抑制剂GZT不同程度缓解铝对根系伸长的抑制作用，降低根尖H2O2含量、Evans blue吸收量和抗氧化酶(SOD、CAT、POD和APX)活性，且DMTU的效应大于其它酶抑制剂。表明，质膜NADPH氧化酶是铝胁迫下小麦根尖H2O2产生的主要来源，细胞壁过氧化物酶和多胺氧化酶对H2O2的产生也有一定程度的贡献。
　　 (5)采用NADPH氧化酶的底物和抑制剂等，研究了铝胁迫下2个小麦基因型根尖NADPH氧化酶活性的变化与H2O2产生的关系。结果表明，NADPH氧化酶抑制剂DPI、H2O2清除剂DMTU可显著降低根尖NADPH氧化酶活性、H2O2含量、Evans blue吸收量和抗氧化酶(SOD、CAT、POD和APX)活性，并缓解铝对根系伸长的抑制；而NADPH氧化酶的底物NADH则提高了根尖NADPH氧化酶活性、H2O2含量、Evans blue吸收量和抗氧化酶(SOD、CAT、POD和APX)活性，并加重铝对根系伸长的抑制作用。这些结果进一步证明了质膜NADPH氧化酶是小麦根尖H2O2产生和积累的主要来源。铝诱导NADPH氧化酶升高，导致H2O2积累，进而引起氧化胁迫是小麦根系伸长受抑的主要原因。
　　 (6)采用促细胞分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)抑制剂、H2O2清除剂和产生相关酶抑制剂等，研究了小麦根尖中铝胁迫诱导的H2O2产生与MAPK信号转导途径的关系。结果表明，30μM铝胁迫下小麦根尖H2O2和MAPK活性显著升高，而PD98059则显著抑制铝胁迫下根尖的H2O2和MAPK活性；Ca通道阻断剂LaCl3和Ca螯合剂EGTA抑制铝诱导产生H2O2，LaCl3对MAPK活性没有显著影响；钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase/calmodulin-like domain protein kinase，CDPK)抑制剂w7对铝胁迫下根尖的H2O2和MAPK活性均无明显影响。外源H2O2预处理显著提高铝胁迫下根尖的MAPK活性，而DMTU、DPI、DDC、GZT、NaN3在降低铝胁迫下根尖H2O2含量的同时显著抑制根尖的MAPK活性。此外，PD98059显著降低铝胁迫下扬麦5号根尖SOD、CAT和POD活性和鉴-864根尖SOD、APX和CAT活性，EGTA显著降低铝胁迫下扬麦5号根尖SOD活性，w7和LaCl3对铝胁迫下根尖的抗氧化酶活性无明显影响。表明，MAPK级联介导了铝胁迫诱导产生的H2O2的信号转导途径，MAPK对铝胁迫诱导的H2O2产生和抗氧化酶活性起到正调控作用。