新型种间杂交南瓜自交系淀粉和类胡萝卜素合成的分子与生理机制研究

摘要

葫芦科作物是世界范围内最重要的十种蔬菜作物之一。中国是南瓜生产第一大国．2009年产量为6，506，966吨。随着经济的发展和人民生活水平的提高，南瓜生产已逐渐从数量型向质量型过渡，对优质品种的需求日益增加。消费者对果实的口感以及安全性、营养价值等有越来越高的要求。提高果实品质是现在南瓜育种工作者的主要目标。
　　 南瓜的品质主要包括:果肉颜色、质地以及甜度等。不同的人群对南瓜果肉质地的喜好不尽相同。中国南瓜（C.moschata)含水量高，干物质的量大概在10-15％．然而由于较低的干物质的量使得很多现在的杂交南瓜品质低下。印度南瓜（C.maxima)因富舍较高的干物质量（大概为20-33％）和较高的品质，因而在许多亚洲中部和南部国家广受欢迎。南瓜中淀粉和糖舍量的变化导致干物质的量不尽相同，而淀粉舍量可以直接影响到南瓜的品质。因此在考虑果实品质时，淀粉舍量和其理化性质可以作为重要的理化指标。
　　 除了碳水化合物，决定南瓜营养品质的主要因素还有类胡萝卜素含量的高低。南瓜作物是重要的饮食材料，同时能在一定程度上改善发展中国家营养缺乏的问题。南瓜果肉颜色丰膏，消费者对果肉颜色的喜好不同。总的类胡萝卜素的舍量与果肉颜色有着正相关性。研究表明果肉具有较深的颜色也是高品质南瓜的特征之一。因此，由于淀粉和类胡萝卜素的重要性，研究它们的合成调控机制对于南瓜的高营养品质育种策略具有重要的指导意义。
　　 葫芦科作物的杂交育种是提高果实品质的一种有效途径。本研究实验材料为南瓜种间自交系，此材料通过C.maxima和C.moschata种间杂交、回交和自交获得，命名为“Maxchata”。本研究的主要目标是明确种间自交系及父母本的果实质地和果肉颜色差异的机制。
　　 首先，对父母本和种间自交系的果肉颗粒形态、干重、直链淀粉和总淀粉舍量进行了研究。此外，对生的和煮熟南瓜的口感、烹饪属性和纹理特征进行了观察。通过扫描电子显徼镜观察发现三个材料的颗粒均表现为表明欠光滑．多为球形、多面体和圆形的复合物，颗粒大小从1μm到17μm不等。C.maxima的颗粒大于C.moschata和“Maxchata1”。 C.maxima和“Maxchata1”的干重和淀粉含量显著高于C.moschata。干重、直链淀粉和总淀粉的含量和果实的粉性成正相关。对于烹饪属性，粉性较高的C.maxima和“Maxchata1”较之粉性较低的C.moschata表现为较长的烹饪时间和较高的硬度。此外．在烹饪过程中C.maxima和“Maxchata1”比C.moschata有较高的固体损失和吸水值。生的和煮熟的C.maxima和“Maxchata1”的高粉性、干重、淀粉含量与其具有较高的TPA参数包括分段能力、硬度、附着力、弹性、筋道等相关。
　　 为了进一步深入了解淀粉以及类胡萝卜素的合成在南瓜果实发育中调控网络，我们从C.moschata.中克隆了相关基因PSY1, PDS, ZDS, CHYB, LCYB, ZEP,GBSS的全长序列，及LCYE, CCD, AGPaseL，SSII, SBEII，ISA1的部分序列。
　　 序列比对显示克隆到以上基因的序列与相应的同源基因的保守结构域有高度的同源性。为了进一步研究南瓜果实发育过程中淀粉和类胡萝卜素积累相关基因表达的调控机理，对相关基因进行了克隆和表达分析。
　　 其次．接下来对两个不同种及其种间自交系南瓜果实发育过程中淀粉积累和淀粉相关基因的转录水平调控进行了研究。对C.maxima、C.moschata和“Maxchata”果实发育不同阶段的干重和淀粉组成进行了研究。此外，对南瓜果实发育过程中淀粉合成相关的5条基因进行了克隆以及通过RT-PCR进行了表达研究。这两个不同种及其种间自交系南瓜的淀粉组成和调控机理具有显著差异。与其他两个材料相比．C.moschata具有较低的总淀粉含量和较低的AGPaseL基因表达水平。在成熟的果实中C.maxima和Maxchata的淀粉含量差异不显著。AGPaseL基因的高表达导致较高的淀粉积累。然而，在“Maxchata”中表现为果实发育早期具有较高的AGPaseL基因表达从而导致淀粉的快速积累。类似的，C.maxima和“Maxchata”中GBSSI基因具有较高的表达水平，与直链淀粉积累水平呈正相关。相反，与支链淀粉合成相关的SSⅡ、SBEⅡ和ISA(I)基因在果实发育后期表达较高，在三个材料中表达差异不显著。
　　 最后，我们研究了南瓜果实的类胡萝卜素的组成及其相关基因的转录调控水平。对C.maxima、C.moschata和两个种间杂交系“Maxchata1”和“Maxchata2”果实发育过程中类胡萝卜素的水平和组成以及类胡萝卜素合成过程中8个相关基因的表达水平进行了比较研究。研究表明，两个南瓜种及其种间杂交种具有不同的类胡萝卜素含量和调控水平。 C.moschata舍有最低的类胡萝卜素含量，且主要为α-胡萝卜素和β-胡萝卜素．果肉表现为浅橙色，低含量的类胡萝卜素含量与该材料中类胡萝卜素合成相关基因的表达水平较低有关，尤其是PSY1基因。 C.maxima中最主要的类胡萝卜素是堇菜黄质和叶黄素，相应的成熟果肉颜色为黄色。在C.maxima果实成熟过程中CHYB和ZEP基因可能导致相似的堇菜黄质和叶黄素积累水平。相反，它们的种间杂交种主要积累叶黄素和β-胡萝卜素，果肉颜色为橙色。在“Maxchata”中PSY1基因在果实发育早期具有较高的表达水平，这可能与其具有高含量的类胡萝卜素有关。相似地．CHYB基因的高表达可能与种间杂交材料中高含量的叶黄素有关。然而，此研究不能从基因表达水平解释β-胡萝卜素的积累。
　　 本研究有助于解释南瓜果实发育过程中淀粉和类胡萝卜素的合成调控机制，能够为进一步提高南瓜高品质育种提高理论基础。

目录

声明

ACKNOWLEDGEMENTS

ABSTRACT

摘要

ABBREVIATIONS

TABLE OF CONTENTS

LIST OF TABLES

LIST OF FIGURES

CHAPTER 1 GENERAL INTRODUCTION AND REVIEW OF LITERATURE

1．1 Background information

1．2 Research objectives

1．3．Review of literature

1．3．1 Characteristics of Cucurbita species

1．3．2 Crossing approaches for development of inter-specific inbred lines

1．3．3 Fruit developmentin Cucurbita species

1．3．4 Texture Evaluation

1．3．5 Role of carbohydrates in squash fruit quality

1．3．6 Role of carotenoids in squash fruit quality

CHAPTER 2 STARCH STRUCTURE，PHYSICOCHEMICAL AND TEXTURAL PROPERTIES OF NOVEL INTER-SPECIFIC INBRED LINE SQUASH FRUITS

2．1 Introduction

2．2 Materials and methods

2．2．1 Plant material and sample preparation

2．2．2 Starch isolation

2．2．3 Starch granule morphology

2．2．4 Determination of total starch

2．2．5 Dry matter assessment

2．2．6 Cooking properties

2．2．7 Water uptake and total solid loss

2．2．8 Textural properties of raw and cooked squashes

2．2．9 Sensory analysis

2．2．10 Statistical analysis

2．3 Results and discussion

2．3．1 Starch granule morphology

2．3．2 Physicochemical and cooking properties of squash fruits

2．3．3 Textural characteristics of raw and cooked squashes

CHAPTER 3 CLONING AND CHARACTERIZATION OF GENES IN CAROTENOID AND STARCH BIOSYNTHESIS

3．1 Introduction

3．1．1 Rapid amplification of complementary DNA ends(RACE)

3．1．2 Overview carotenoid biosynthesis pathway

3．1．3 Overview starch biosynthesis pathway

3．2 Materials and methods

3．2．1 Total RNA isolation and cDNA synthesis

3．2．2 Primer design

3．2．3 Cloning of cDNA encoding carotenoid and starch related genes

3．2．4 Sequence analysis and multiple alignments

3．3 Results and discussion

3．3．1 Phytoene synthase(PSY)

3．3．2 Phytoene desaturase(PDS)and ζ-carotene desaturase(ZDS)

3．3．3 Lycopene β-cyclase(LCYB)and Lycopene ε-cyclase(LCYE)

3．3．4 β-carotene hydroxylass(CHYB)

3．3．5 Zeaxanthin epoxidase(ZEP)

3．3．6 Carotenoid cleavage dioxygenase(CCD)

3．3．7 ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit(AGPaseL)

3．3．8 Granule-bound starch synthase(GBSS)and Soluble starch synthase(SSS)

3．3．9 Starch branching enzyme(SBE)

3．3．10 Starch debranching enzyme-isoamylase type(ISA)

CHAPTER 4 STARCH ACCUMULATION AND STARCH RELATED GENES EXPRESSION IN NOVEL INTER-SPECIFIC INBRED SQUASH LINES AND THEIR PARENTS DURING FRUIT DEVELOPMENT

4．1 Introduction

4．2 Materials and methods

4．2．1 Plant material

4．2．2 Dry matter assessment

4．2．3 Stareh isolation

4．2．4 Determination of amylose and amylopectin

4．2．5 Total RNA isolation

4．2．6 Quantitative real time PCR analysis

4．3 Results and discussion

4．3．1 Percent dry matter and starch accumulation during fruit development

4．3．2 Expression profiles of starch related genes

CHAPTER 5 CAROTENOID ACCUMULATION AND CAROTENOGENIC GENE EXPRESSION DURING FRUIT DEVELOPMENT IN NOVEL INTER-SPECIFIC INBRED SQUASH LINES AND THEIR PARENTS

5．1 Introduction

5．2 Materials and methods

5．2．1 Plant materials

5．2．2 Carotenoid extraction

5．2．3 HPLC analysis of carotenoids

5．2．4 Total RNA isolation and cDNA synthesis

5．2．5 Quantitative real time PCR analysis

5．3 Results and discussion

5．3．1 Color changes of squash fruit flesh during fruit development

5．3．2 Changes in carotenoid composition in the fruit flesh of squashes

5．3．3 Carotenogenic gene expression profiles during squash fruit development

CHAPTER 6 OVERALL CONCLUSIONS AND FUTURE PROSPECTS

6．1 Overall conclusions

6．2 Future prospects

REFERENCES