荧光原位杂交法检测TERC基因在宫颈癌筛查中的应用

摘要

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，严重危害女性健康。业已公认高危人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发生的必要条件。但从HR-HPV感染妇女诱发宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)发展为浸润性官颈癌(invasive cervical cancer，ICC)约需5-20年时间，这为通过筛查发现并治疗癌前病变以降低宫颈癌的发病率和死亡率赢得了时间。
　　细胞学检查因其快速、价廉，是目前最常用的方法，在宫颈筛查中仍起着重要作用，并被许多国家作为常规筛查项目。但细胞学检查并不十分可靠，具有较高的假阴性，通常需要重复检查才能获得满意的敏感度，且巴氏涂片在腺癌检测中的敏感度比鳞癌更低。虽然薄层液基细胞学(ThinPrep liquid-based cytology test，TCT)等新技术的出现改善了细胞学的制片问题，但并没有彻底改变其敏感度低的现状，这也制约着细胞学筛查的发展。
　　HPV检测是宫颈癌筛查的另一项重要方法。在欧洲国家，HPV检测正在取代细胞学检查，成为官颈病变初筛的首选。HPV检测具有很高的敏感性，在大样本筛查中可浓缩高风险人群，比细胞学筛查更为有效。但HPV的感染非常普遍，据统计，性活跃妇女终生累积感染率可高达80％。这种感染通常是一过性的，可通过自身免疫系统及时清除，并不导致高度CIN及官颈癌的发生.因而，HPV检测通常具有较高的假阳性，尤其在年轻女性中其特异性更低。
　　故从宫颈癌筛查及早期诊断的角度出发，有必要寻找新的手段来替代或协助常规筛查方法进行综合判断，使官颈癌的筛查更加准确、可靠、富有预见性.许多针对宫颈癌的研究表明，宫颈上皮细胞由高度CIN向ICC转变的过程中常常伴有3号染色体长臂(3q)的扩增。其中，涉及到的最重要基因可能是位于3q26.3的端粒酶RNA基因(telomerase RNA component，TERC)。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，导致肿瘤发生，是宫颈癌形成的早期事件。已经有较多学者研究了 FERC在不同细胞学及组织学分级中的表达，然而就TERC在官颈癌筛查中的作用及其与细胞学检查、HPV检测三者在宫颈癌筛查中的相关性，目前尚缺乏系统性研究。
　　本研究拟采用荧光原位杂交(fluorecence in situ hybridization，FISH)技术分别检测官颈疾病门诊患者、细胞学异常者、HR-HPV阳性者宫颈脱落细胞中TERC的表达，并以组织学诊断作为金标准，同细胞学、HR-HPV结果进行比较，评估TERC在宫颈癌筛查中的作用，为宫颈癌的筛查及早期诊断提供新的方法。
　　第一部分 TERC在宫颈鳞癌初筛中的应用
　　目的：
　　评价FISH检测TERC表达的效能，并探索其作为初筛手段应用于预测宫颈鳞癌及癌前病变的价值。
　　方法：
　　收集201例宫颈疾病门诊患者的TCT标本。所有参与者均行细胞学检查、HR-HPV HC2(Hybrid Capture2，第二代杂交捕获)、TERC FISH、阴道镜检查，并视情况行活检及组织学诊断。分析TERC表达与细胞学、HR-HPV及组织学之间的关系，并以≥CINⅡ作为阳性标准，评价细胞学、HR-HPV HC2及TERC FISH三种筛查方法的优劣，评估TERC FISH作为官颈鳞癌初筛手段的可行性。统计分析采用χ2检验或Fisher’s精确检验。
　　结果：
　　1.TERC表达在NILM(negative for intraepithelial or malignancy，未见上皮内病变或恶性病变)、ASC-US(atypical squamous cells of undetermined significance，意义未明的非典型鳞状细胞)、LSIL(low-grade squamous intraepithelial lesion，低度鳞状上皮内病变)、ASC-H(atypical squamous cells cannot exclude high-gradesquamous intraepithelial lesion，不除外高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞)及HSIL(high-grade squamous intraepithelial lesion，高度鳞状上皮内病变)中的阳性率分别为2.83％、17.39％、37.50％、62.96％及90.48％，且≤LSIL与≥ASC-H组间TERC阳性率存在显著差异(P<0.001)。
　　2.TERC表达在HR-HPV阴性组及阳性组中的阳性率分别为4.85％和47.96％，两组间存在显著差异(P<0.001)。
　　3.TERC表达在正常、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈鳞癌中的阳性率分别为6.06％、10.00％、66.67％、72.50％及100.00％，且在≤CINⅠ和≥CINⅡ组间TERC阳性率存在显著差异(P<0.001)。
　　4.在细胞学、HR-HPV与TERC三种筛查方法的比较中，TERC的敏感性及阴性预测值(negative predictive value，NPV)低于HPV检测，与细胞学相当，但其特异性、阳性预测值(positive predictive value，PPV)及准确性明显优于细胞学与HR-HPV(P<0.05)。
　　结论：
　　1.FISH检测宫颈鳞状上皮病变中TERC的表达与细胞学、组织学分级及HPV检测结果间具有良好的一致性。
　　2.FISH检测TERC具有较高的特异性和准确性，可作为初筛手段应用于宫颈鳞癌的筛查。
　　第二部分 TERC在宫颈鳞癌初筛后的分层作用
　　目的：
　　评估FISH检测TERC表达应用于官颈鳞癌初筛后的分层价值。
　　方法：
　　在细胞学初筛后的分层中，选择宫颈疾病门诊TCT诊断为ASC-US和LSIL的患者376例(其中ASC-US242例，LSIL134例)；在HR-HPV初筛后的分层中，选择HR-HPV HC2阳性的患者177例；在初筛后结果为HR-HPV阳性、细胞学轻中度异常的分层中，选择TCT诊断为ASC-US、LSIL和ASC-H，同时HR-HPV阳性的患者300例(其中ASC-US129例，LSIL82例，ASC-H89例)。所有患者均行细胞学检查、HR-HPV HC2、TERC FISH、阴道镜检查，并视情况行活检及组织学诊断。以≥CINⅡ作为阳性标准，计算TERC在不同组别分层中的敏感性、特异性、PPV、NPV及准确性，并与相应的分层手段进行比较，评估TERC作为分层手段的优劣。统计分析采用χ2检验或Fisher’s精确检验、方差分析及非条件Logistic回归分析。
　　结果：
　　1.在初筛后细胞学ASC-US的分层中，HR-HPV的敏感性优势依然存在(97.73％)，而TERC的特异性及准确性优势则较为突出(90.40％及87.19％)；在初筛后细胞学LSIL的分层中，TERC的敏感性及NPV与HR-HPV无差异(P>0.05)，同时
　　TERC具有更高的PPV、特异性及准确性(P<0.001)。
　　2.在初筛后HR-HPV阳性的分层中，进一步结果尚需更多样本证实。从目前趋势来看，TERC的敏感性优于或至少与细胞学相当(83.33％vs.50.00％，P=0.545)，而特异性两者间无差异(P=0.336)。
　　3.在初筛后HR-HPV阳性、细胞学轻中度异常的分层中，TERC在ASC-US、LSIL
　　及ASC-H中预测CINⅡ+的敏感性分别为81.82％、83.33％、91.94％，特异性分别为93.46％、91.37％、88.89％，准确性分别为91.47％、89.02％、91.01％，均获得了满意的分层效果。TERC在不同细胞学、HR-HPV病毒载量及年龄分组中的敏感性、特异性及准确性均无差异，且其平均阳性细胞比率随病变级别升高而增加。
　　结论：
　　1.在细胞学ASC-US的分层中，TERC检测与HPV检测相比，具有更高的特异性及准确性；在细胞学LSIL，的分层中，TERC是一种有效的分层手段。
　　2.在HR-HPV阳性的分层中，TERC检测的敏感性及特异性与细胞学检查相当或更高，是一种细胞学以外可供选择的分层手段。
　　3.在HR-HPV阳性、细胞学轻中度异常的分层中，TERC是一种敏感、特异、稳定的分层手段。
　　第三部分 TERC应用于细胞学检查腺细胞异常辅助诊断的初步探讨
　　目的：
　　初步探讨FISH检测TERC表达在细胞学检查为腺细胞异常时作为辅助诊断的价值。
　　方法：
　　选择宫颈疾病门诊TCT诊断为腺细胞异常的患者35例(其中AGC(atypicalglandular cells，非典型腺细胞)-NOS(not otherwise specified，无其他特殊意义)19例，AGC倾向瘤变9例，腺癌7例)。所有患者行HR-HPV HC2、TERC FISH、阴道镜下活检、颈管搔刮术(endocervical curettage，ECC)及组织学诊断。分析TERC表达与腺细胞异常的细胞学及组织学分级之间的关系，评估TERC FISH作为筛查手段应用于宫颈腺癌预测中的可行性。统计分析采用χ2检验或Fisher’s精确检验。
　　结果：
　　1.TERC表达在AGC-NOS、AGC倾向瘤变、腺癌中的阳性率分别为36.84％、88.89％、100.00％，且AGC-NOS与>AGC-NOS组间TERC阳性率存在差异(P=0.047)。
　　2.TERC阳性比例随宫颈病变组织学级别升高而增高，在宫颈原位腺癌(adenocarcinoma in situ，AIS)与浸润腺癌中均达到100.00％。
　　结论：
　　FISH检测TERC的表达与宫颈腺细胞异常的细胞学、组织学分级间存在良好的相关性，可用于细胞学检查为腺细胞异常的辅助诊断。