强心苷类药物抑制低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达的机制研究

摘要

目的：最近研究表明，强心苷类药物除可应用于治疗心血管疾病，还可预防与治疗肿瘤，且其抗肿瘤作用可能与抑制低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达密切关系，但强心苷类药物如何调节HIF-1α蛋白的分子机制尚未阐明。本课题探讨强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达的分子靶点，为临床上强心苷类药物合理应用治疗肿瘤提供科学依据，也为设计HIF-1α蛋白抑制剂提供新思路。
　　 方法：(1)Western Blot法和TR-PCR法分别检测强心苷类药物作用后相关蛋白表达和mRNA水平的变化；(2)运用siRNA技术分别对肿瘤细胞内eIF-20α，Na+/K+-ATPase和eIF4E基因进行沉默，检测基因沉默后强心苷类药物对HIF-1α蛋白水平影响的变化；(3)运用质粒转染技术，过表达eIF4E蛋白，检测强心苷类药物对HIF-1α蛋白水平影响的变化；(4)计算机分子对接模型预测强心苷类药物与蛋白翻译相关因子的结合能量参数；(5)采用兔网织红细胞体外翻译体系，检测强心苷类药物在体外对蛋白质翻译影响的变化；(6)采用改良的两套报告基因体系，评价强心苷类药物对细胞内“帽”(cap)依赖性蛋白质翻译的影响；(7)运用免疫沉淀法检测药物作用后，eIF4E与HIF-1α mRNA、eIF4G蛋白结合水平的变化；(8)采用sRB染色法评价eIF4E在Ouabain抑制肿瘤细胞增殖中的作用。
　　 结果：
　　 1强心苷类药物可抑制低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达选取不同来源肿瘤细胞(OVCAR8，AGS，HePG2，Hela，U2OS)，在低氧下用Ouabain(100，200，400，800nM)处理细胞8小时，Western Blot结果显示，在各细胞株中Ouabain对HIF-1α蛋白表达的减少呈现浓度依赖性；此外，Ouabain能下调氯化钴引起的HIF-1α蛋白表达，并呈现浓度依赖性；强心苷类药物ProscillaridinA也能有效地下调HIF-1α蛋白的表达，且有效浓度低于Ouabain。而Digitonin在浓度为1μM范围内不能下调HIF-1α蛋白的表达。
　　 2强心苷类药物可减少HIF-1α蛋白合成从而影响其蛋白表达
　　 荧光定量PCR及半定量PCR结果显示，U2OS细胞经Ouabain作用后，HIF-1αmRNA水平无显著性变化；Western Blot实验结果显示，在U2OS细胞中Ouabain并未加速HIF-1α蛋白的降解；蛋白酶体抑制剂MG132未逆转Ouabain引起的HIF-1α蛋白下调。上述结果提示Ouabain抑制HIF-1α蛋白的表达可能是由于减少HIF-1α蛋白的合成。进一步实验结果显示，强心苷类药物Ouabain(100 nM)和ProscillaridinA(50 nM)能有效地抑制HIF-1α蛋白合成。
　　 3 mTORC1、eIF2α和Na+/K+ATPase并不参与强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达的过程
　　 Western Blot检测结果显示，U2OS细胞经Ouabain作用后，Ouabain对mTOR、4E-BP1的原型及其磷酸化水平均无明显变化，提示mTORC1/4E-BP1信号通路在这一过程中未发挥重要作用；虽然强心苷类药物作用后eIF2α磷酸化水平明显上升，但没有抑制HIF-1α蛋白表达作用的Digitonin同样地也能上调eIF2α的磷酸化水平。此外，用siRNA沉默eIF2α后并未观察到有逆转强心苷类药物对HIF-1α抑制的作用，提示eIF2α信号通路也未在这一过程中发挥重要作用；进一步实验证实，siRNA沉默Na+/K+-ATPase对强心苷类药物引起HIF-1α下调作用无影响，却能上调eIF2α磷酸化水平，但在Na+/K+-ATPase基因敲除后Ouabain并未明显地引起eIF2α磷酸化水平上调，表明强心苷类药物激活eIF2α信号通路可能是由于抑制Na+/K+-ATPase的活性所导致的，进一步证实eIF2α信号通路不参与强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达的过程中。
　　 4强心苷类药物抑制“帽”依赖性蛋白质翻译过程
　　 应用兔网织红细胞裂解液体外翻译体系，发现Ouabain较好地抑制蛋白质翻译过程；根据计算机分子拟合结果，我们发现强心苷类药物与真核细胞翻译起始因子eIF4E有较好的相互作用。我们采用改良的两套蛋白质翻译调控体系来研究强心苷类药物对eIF4E调控的“帽”依赖性蛋白质翻译的影响，结果发现Ouabain能抑制eIF4E调控的“帽”依赖性蛋白质翻译，对“帽”非依赖性蛋白质翻译无影响；此外，我们还观察到Ouabain能在转录后水平上抑制Cyclin D1蛋白的表达，进一步明确Ouabain能较好地抑制eIF4E的活性。
　　 5 eIF4E在强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达中的作用
　　 在前列腺癌(DU145)，骨肉瘤(U2OS)，肝癌(HepG2和SMMC-7721)，肺癌(A549和95D)，卵巢癌(SKOV3)和宫颈癌(HeLa)等8株细胞株中，我们发现eIF4E蛋白与HIF-1α蛋白表达存在着较好的正相关性(R=0.882，P=0.004)；在U2OS细胞中将eIF4E沉默后，HIF-1α蛋白表达水平明显下降，而过表达eIF4E，结果则相反，即HIF-1α蛋白表达水平明显上调；此后，考察eIF4E在强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达中的作用，发现eIF4E沉默后可逆转强心苷类药物Ouabain和Proscillaridin A所引起HIF-1α蛋白表达的下调，而外源性过表达的eIF4E能减弱强心苷类药物Ouabain和Proscillaridin A对HIF-1α蛋白表达的抑制作用，并呈浓度依赖性。这些结果说明强心苷类药物可能通过抑制eIF4E的活性来抑制HIF-1α蛋白表达；免疫沉淀结果发现，强心苷类药物不是通过阻断eIF4E和HIF-1αmRNA之间的结合，而是通过阻断eIF4E/eIF4G之间的结合来抑制eIF4E的功能从而发挥其抑制HIF-1α蛋白表达的作用。此外，过表达eIF4E能减弱强心苷类药物Ouabain对肿瘤细胞增殖抑制作用。
　　 结论：本文对强心苷类药物抑制HIF-1α蛋白表达的作用及对其作用机制进行了深入的研究。经研究发现，强心苷类药物Ouabain和Proscillaridin A能不同程度地抑制细胞内HIF-1α蛋白表达；这种抑制作用不是通过阻断mTOR，eIF2a和Na+/K+-ATPase这些信号通路，更不是阻断eIF4E和底物mRNA之间的结合所致，而是通过阻断eIF4E/eIF4G之间的结合来抑制蛋白质翻译起始复合物eIF4F的形成所导致的。本课题研究强心苷类药物抑制低氧诱导因子HIF-1α蛋白表达的作用及其分子机制，不仅为强心苷类药物在临床上的抗肿瘤应用奠定了理论基础，也为设计HIF-1α蛋白抑制剂提供了新思路。