强心苷类药物对结肠癌细胞的抑制作用及体外机制研究

摘要

背景：
　　强心苷类药物包括oleandrin，对许多不同类型的癌细胞具有细胞毒性作用，在前期的高通量筛选中，发现一些强心苷类药物能够特异性地杀死人结肠癌细胞。其中，oleandrin就是一种植物来源于夹竹桃的强心苷类药物，其抗肿瘤作用机制仍有很多方面并没有被清楚的阐释。本文便以oleandrin对人结肠癌细胞的作用及潜在的机制进行探讨。
　　目的：
　　本文主要通过体外研究oleandrin对人结肠癌细胞生长的影响及对SW480细胞的潜在机制，为体外研究强心苷药物治疗人结肠癌提供理论基础。
　　方法：
　　1.MTT法对强心苷类小分子化合物IC50的测定。
　　2.CCK-8法检测Oleandrin对结肠癌细胞的体外抑制作用:检测对SW480细胞以及人正常上皮细胞NCM460的细胞活性。测定在孵育不同时间下对结肠癌SW480细胞生长抑制作用;对HCT116，RKO，SW480不同结肠癌细胞的影响;以及5-氟尿嘧啶IC50值的测定。
　　3.Oleandrin对结肠癌细胞的体外诱导凋亡作用机制的研究:以AnnexinⅤ-FITC和PI标记的试剂，检测细胞周期、凋亡情况;钙离子荧光探针Fluo-3，AM检测结肠癌细胞内Ca2+浓度的变化;Caspase-3，9活性检测试剂盒来考察Caspase-3，9的活化程度;蛋白免疫印迹分析法(Western blot)对相关凋亡蛋白cytC，BAX，BCL-2，Caspase-3，9的表达情况检测;谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒检测细胞内GSH含量。
　　结果：
　　1.在5个强心苷类小分子化合物中，oleandrin的IC50值最低(0.02μM)，处理24h后，高剂量的oleandrin并没有显著影响结肠上皮细胞的活性(IC50=0.56μM)。
　　2.Oleandrin显著抑制SW480细胞生长，具有浓度依赖关系;处理时间24h与48h、72h两组相比，有显著性差异(p＜0.05），而48、72h处理时间组相比，无显著性差异，各组与阴性对照组相比，均存在显著性差异(p＜0.01，p＜0.001)。Oleandrin对RKO/SW480/HCT116细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性(p＜0.01，p＜0.001)。其IC50值显著低于5-FU(IC50=22.75μM)。
　　3.Oleandrin对结肠癌细胞能够阻滞G2/M期，并诱导凋亡，与阴性对照组相比，具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.01);能够增加胞内Ca2+水平;在0.02μM的oleandrin处理SW480细胞后，能够时间依赖性增加细胞内活化的Caspase-3，9水平;Western blot显示能够上调cytC，BAX蛋白表达，下调BCL-2，Procaspase-3，9蛋白的表达;与阴性对照组相比，具有显著性差异(p＜0.05，p＜0.001);能剂量依赖性的降低SW480细胞内的GSH水平。
　　结论：
　　1.Oleandrin在5种小分子化合物中IC50值最低，为0.02μM。在48h，作用抑制率达最大值;对HCT116，RKO在内的其它结肠癌细胞同样抑制生长;其IC50值明显低于5-FU。
　　2.Oleandrin能阻滞SW480和RKO细胞G2/M期，诱导早期凋亡;具有时间及浓度依赖性的增加细胞内Ca2+水平;呈时间依赖性增加细胞内活化的Caspase-3，9水平，且在8h后，活化的Caspase-3水平达到最大值;蛋白表达检测说明其引起凋亡的过程与细胞线粒体信号通道和凋亡酶的激活途径关联。能够浓度依赖地降低SW480细胞内的GSH水平。

目录

摘要

前言

第一章 强心苷类小分子化合物的筛选以及IC50的测定

1 材料与仪器

1．1 主要仪器设备

1．2 实验细胞系

1．3 实验小分子化合物

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 常用溶液的配制

2．2 人结肠癌SW480细胞培养

2．5 细胞复苏

2．6 细胞形态学观察

2．7 细胞计数

2．8 MTT法筛选各小分子化合物的IC50值

3 实验结果

3．1 MTT法测定各强心苷类小分子化合物对SW480细胞的活性

3．2 不同浓度的小分子化合物对SW480细胞的IC50值

4 讨论

5 小结

第二章 Oleandrin对结肠癌细胞的体外抑制作用的研究

1 材料与仪器

1．1 主要仪器设备

1．2 实验细胞系

1．3 实验药物

1．4 实验试剂

2 实验方法

2．1 CCK-8法检测细胞的增殖毒性实验原理

2．2 Oleandrin对SW480细胞的增殖毒性实验方法

2．3 不同时间点oleandrin对细胞的增殖毒性

2．4 检测oleandrin对其它结肠癌细胞的作用

2．5 比较oleandrin与阳性药物5-FU的作用效果

3 实验结果

3．1 不同浓度的oleandrin对SW480细胞增殖的影响

3．2 不同时间点oleandrin对细胞的增殖毒性

3．3 Oleandrin对其它结肠癌细胞的作用

3．4 比较oleandrin与阳性药物5-FU的作用效果

4 讨论

5 小结

第三章 Oleandrin对结肠癌细胞凋亡作用机制的研究

1 材料与仪器

1．1 主要仪器设备

1．2 实验细胞系

1．3 实验药物

1．4 实验试剂

1．5 主要试剂的配制

2 实验方法

2．1 细胞周期分布检测

2．3 检测结肠癌细胞内Ca2+浓度的变化

2．4 Caspase-3，9的活化程度的检测

2．5 蛋白免疫印迹法分析蛋白表达(Western Blot)

2．6 检测细胞内谷胱甘肽(GSH)含量

2．7 结果分析

3 实验结果

3．1 细胞周期分布检测

3．2 AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

3．4 Oleandrin对SW480，RKO细胞Caspase-3，9酶活性的影响

3．5 蛋白免疫印迹分析

3．6 检测胞内Glutathione(GSH)的含量

4 讨论

5 小结

全文总结

缩写词中英文对照表

实验所用到的细胞株

攻读学位论文期间成果

致谢

声明

参考文献