低氧选择性药物TPZ对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控作用机制研究

摘要

目的：低氧是实体瘤普遍存在的一个重要微环境，在肿瘤的发展、新生血管的形成、肿瘤对放疗和化疗的耐药，乃至恶性侵袭转移等方面都起着极其重要的作用。HIF-1是介导肿瘤细胞和组织适应低氧微环境的关键转录因子之一，因此HIF-1作为一个潜在的肿瘤治疗靶点而广泛受人关注。TPZ是目前处于临床Ⅲ期研究的低氧选择性抗肿瘤药物。据文献报道，TPZ在低氧环境下主要是作为—个拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂而发挥抗肿瘤作用，但其对HIF-1α作用并未见文献报道，我们的前期结果发现TPZ能抑制低氧诱导的HIF-1α的表达，故本实验主要探讨了TPz抑制HIF-1α的表达的可能的作用机制,以期对TPZ的抗肿瘤作用有进一步的了解。方法：采用Western Blotting法检测细胞内HIF-1α及其相关蛋白的表达水平;用双荧光素酶检测法测定细胞内HIF-1α转录活性的变化：应用Real time-PCR法检测HIF-1α的mRNA表达水平;siRNA沉默关键蛋白(4E-BP1，TSC2，topoisomeraseⅡα, eIF2α)从而考察该蛋白在TPZ降HIF-1α过程中的作用；用移植瘤裸鼠模型评价了TPZ在体内对HIF-1α的影响。结果：(1)在不同来源细胞株中（Hela、HepG2、SMMC-7721、HCT116, OVCAR8和HEK-293）．TPZ均能有效抑制低氧诱导的HIF-1α蛋白的累积和转录活性；(2)Western Blotting和RT-PCR检测结果显示．TPZ能有效抑制低氧诱导产生的HIF-1α蛋白的表达，但并不影响HIF-1α蛋白的降解和mRNA水平，说明TPZ通过影响蛋白质的翻译过程抑制了HIF-1α的合成：(3)Westem Blotting检测结果显示TPZ作用后虽然p-mTOR( Ser2448)，p-4EBPI(Ser65)蛋白含量均明显减少且mTORC1复合物活性下降，但siRNA沉默4E-BP1或TSC2后并没有逆转TPZ对HIF-Ia的抑制作用，说明mTORCI/4E-BPI信号通路并没有在这一过程中发挥重要作用：(4)在TPZ抑制低氧诱导的HIF-1α蛋白累积的过程中伴随着p-eIF2α和ATF4的上调，提示eIF2α信号通路可能与TPZ诱导的HIF-1α蛋白的下调密切相关，此外采用siRNA技术沉默肿瘤细胞内eIF2α蛋白后发现能降低低氧诱导的HIF-1α蛋白累积的基础值，并能部分逆转TPZ对HIF-1α的翻译抑制；(5)Western Bloting检测和siRNA沉默结果显示TPZ仅在低氧下能发挥降HIF-1α的作用，且这—作用与TPZ的拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用无关．(6)荷HepG2人肝癌细胞的裸小鼠评价TPZ的体内降HIF-1α的作用结果显示经TPZ,作用后瘤组织内的HIF-1α表达水平明显下降，此外组织切片免疫荧光结果也表明在HIF-lα表达水平下降的过程中伴随着p-eIF2α表达水平的上升。结论：TPZ在低氧环境中通过激活eIF2α信号通路，阻断HIF-lα蛋白质的翻译，从而发挥其体内外的抑制HIF-Iα蛋白累积的作用．