miR-126-Racl/p67phox信号在淫羊藿苷促小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞中的关键作用研究

摘要

胚胎干(embryonic stem，ES)细胞是能在体外自我更新并具有多分化潜能的细胞，可分化为功能性心肌细胞，应用于心脏发育生理学、心脏病理学及新药发现等研究。本课题前期研究发现淫羊藿苷（icariin，ICA）能够通过激活活性氧(reactive oxygen species，ROS)信号通路促进小鼠ES细胞分化为心肌细胞，但关于ICA如何促ROS生成的作用机制还知之甚少。同时，本课题组前期利用蛋白组学技术研究了ICA促ES细胞成心体系中整套蛋白表达谱及功能，但对ICA促心肌分化是否涉及转录后调控和翻译后修饰尚不清楚。本研究主要目的是从转录后调控和翻译后修饰层面进一步论证ICA的促分化作用，揭示其促心肌分化的启动机制，为阐明其诱导分化机理作用提供实验依据，也为发展其新的应用提供理论依据。
　　鉴于NADPH氧化酶(NADPH oxidases，NOXs)产生的ROS在ES细胞心肌分化中发挥关键作用，课题组前期研究了其中的一个亚型NOX4在ICA促心肌分化中的作用。研究发现除了NOX4的激活不需要胞浆亚基外，其它亚型激活都需要胞浆亚基，但其它亚型NOXs在ES细胞分化心肌中是否被激活，及激活所涉及必需胞浆亚基尚不清楚。作为NADPH氧化酶的胞浆亚基，Rac1异戊烯化修饰后锚着在细胞膜上对ROS生成至关重要。此外，Rac1与其他胞浆亚基，如p67phox结合也是NOX激活产生ROS的关键一步。据此，本研究第一部分提出了Rac1异戊烯化激活是ICA促ES细胞心肌分化的早期分子事件假说;并运用siRNA沉默Rac1（si-Rac1）、Rac1CAAX残基缺失(Rac1△)质粒、牛儿基转移酶-Ⅰ(geranylgeranyl transferases type-Ⅰ，GGTase-Ⅰ)抑制剂GGTI-298，法尼基转移酶（famesyl transferase，FTase）抑制剂FTI-277和Rac1-GTP装载抑制剂NSC23766四步法，从翻译后修饰层面探索ICA促心肌分化的可能机理。
　　近年来，众多研究显示微小RNA(microRNAs，miRNAs)在ES细胞心肌分化中发挥重要调控作用。基于miRNAs芯片分析，我们发现miR-126在ICA促ES细胞心肌分化中显著上调，且其拟似物或拮抗剂可分别增强或削弱心肌分化作用，提示miR-126在心肌分化过程中发挥关键作用。文献报道，miR-126可提高血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的促血管生成作用，且VEGF与ROS形成密切相关。另有研究报道，分化d4 Flk-1+（Flk-1阳性）细胞高表达miR-126。因此，本研究第二部分提出miR-126通过调节VEGF及其受体Flk-1介导Rac1-p67phox复合物在细胞膜上锚着，进而激活ROS产生这一假说;并运用miR-126拟似物，miR-126拮抗剂，siRNA沉默Flk-1和Flk-1抑制剂SU5416从转录后调控层面探索ICA促心肌分化的可能机理。
　　ROS-Ca2+信号作为可兴奋细胞的重要生命活动，对心肌细胞正常生理功能的维持举足轻重。有研究报道在血管细胞中ROS可以激活内质网钙调控蛋白。内质网作为胞内重要的钙储存细胞器，参与调节胞内钙平衡，调控各种信号通路。内质网中的钙离子动态平衡过程由兰尼碱受体（ryanodine receptors，RyRs）、IP3受体（inositol(l)，4，5-triphosphate receptors，IP3Rs）以及肌浆（内质）网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)协调运作控制。因此，本研究第三部分探索了miR-126-Rac1/p67phox-ROS-Ca2+信号通路在ICA促ES细胞心肌分化中的作用。
　　1.Rac1异戊烯化激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究
　　为探索Rac1异戊烯化激活是否介导ICA促ES细胞心肌分化过程，本研究首先考察了Rac1异戊烯化激活对ICA促ROS生成的调控作用，采用ROS荧光染料DCF-DA检测了si-Rac1，Rac1△质粒，GGTI-298，FTI-277和NSC23766对ICA促拟胚体（embryoid bodies，EBs）内ROS水平影响。Western blot检测ICA对Rac1从胞浆向胞膜移位的影响。免疫荧光法检测Rac1△对心肌特异性肌小节蛋白α-辅肌动蛋白(α-actinin)的影响。
　　实验结果显示，ICA作用EBs0.5，1，2，4h能时间依赖性诱导Rac1从胞浆向细胞膜移位，当用si-Rac1，Rac1△，GGTI-298或NSC23766时，ICA促ROS产生作用消失，但是FTI-277却无此作用。si-Rac1，Rac1△，GGTI-298或NSC23766均能显著抑制ICA促ES细胞心肌分化作用，表现为心肌分化率降低，心肌转录因子Nkx2.5和心肌小节蛋白α-actinin表达减少，但FTI-277并不能抑制ICA促分化作用。本实验结果提示Rac1 CAAX端被20碳牛儿基异戊烯化激活，调节ROS生成介导ICA促ES细胞心肌分化过程。
　　2.miR-126参与VEGF及其受体Flk-1激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究
　　第一部分研究了ROS上游靶点Rac1激活在ICA促ES细胞心肌分化中的作用，基于上述研究结果，为进一步明确ROS上游信号分子在ICA促ES细胞心肌分化中的角色，本部分着重对miR-126，VEGF及Flk-1进行了考察。采用Western blot法检测ICA对VEGF和Flk-1表达的影响。miRNAs芯片技术检测ICA介入后miRNAs差异表达谱。进一步利用Flk-1抑制剂SU5416，siRNA沉默Flk-1（si-Flk-1），miR-126拟似物和miR-126抑制剂研究miR-126介导VEGF及其受体Flk-1对ICA促ES细胞心肌分化的影响。
　　实验结果显示，VEGF在d5 EBs时高表达，随着EBs向心肌细胞分化，VEGF显著下调(d5～d5+3)，之后VEGF表达相对不变。Flk-1在整个分化过程中都有表达。ICA作用3天后能一定程度上增加VEGF表达。MTT结果显示，5μM，2.5μM和1μM SU5416对ES细胞均无增值抑制作用。在d5 EBs时加入5μM，2.5μM或1μM SU5416并不能抑制ES细胞自发的心肌文化，表现为心肌分化率增加，α-actinin表达上调。但在d0加入1μM SU5416就可以显著抑制ES细胞自发的心肌文化和ICA促ES细胞心肌文化，表现为心肌分化率降低，Nkx2.5和α-actinin表达减少。
　　miRNAs芯片结果显示，在d5+3，ICA可以诱导miR-126表达增加2.115倍。qRT-PCR结果确证了miR-126的差异表达。ES细胞转染miR-126拟似物可以促进其分化为心肌细胞，表现为心肌分化率增加，VEGF，Nkx2.5和α-actinin表达上调，Rac1-p67phox复合物形成和ROS生成增多。ES细胞转染miR-126抑制剂可以抑制ICA促ES细胞心肌文化，表现为心肌分化率降低，VEGF，Nkx2.5和α-actinin表达下调，Rac1-p67phox复合物形成和ROS生成减少。本实验结果提示miR-126通过调节VEGF及其受体Flk-1介导Rac1-p67phox复合物在细胞膜上锚着，进而激活ROS产生。
　　3.miR-126-Rac1/p67phox-ROS-Ca2+信号通路在ICA促ES细胞心肌分化中作用研究
　　在第一部分和第二部分的基础上，为进一步明确ROS下游信号分子在ICA促ES细胞心肌分化的作用，第三部分着重对Ca2+和内质网钙调控蛋白进行了考察。采用荧光光度法测定EBs内Ca2+浓度;免疫荧光双染法测定内质网钙调控蛋白RyR2，IP3R2或SERCA2与α-actinin共定位情况;Western blot法测定RyR2，IP3R2和SERCA2表达;活细胞工作站测定Ca2+瞬变。
　　实验结果显示，ICA能增加d5 EBs内Ca2+浓度，提高心肌分化过程中RyR2，IP3R2和SERCA2表达水平;在d5+7上述内质网钙调控蛋白与α-actinin均有较好的共定位;ICA尚能提高d5+11（分化末期）心肌细胞内Ca+瞬变幅度。miR-126抑制剂可抑制ICA促ROS生成，进而下调上述作用。
　　结论:
　　1.Rac1 CAAX端被牛儿基（20碳）异戊烯化激活是ICA促ES细胞心肌分化的早期分子事件，该作用与其锚着细胞膜并与p67phox结合激活NOXs促ROS生成相关。
　　2.ICA促分化早期miR-126可能经由VEGF/Flk-1信号参与Rac1-p67phox复合物在细胞膜上聚集，激活NOXs而促ROS生成。
　　3.ROS-Ca2+信号介导ICA促心肌分化过程，miR-126抑制剂通过抑制ROS生成导致分化早期EBs内Ca2+浓度降低，分化中期内质网钙调控蛋白表达下调和分化末期心肌细胞内Ca2+瞬变幅度减小。

目录

声明

论文说明

致谢

前言

摘要

论文创新点

缩略词表

1．Rac1异戊烯化激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究

引言

1．1 实验材料

1．1．1 细胞株

1．1．2 仪器

1．1．3 试剂、抗体及耗材

1．1．4 常用液体配制

1．2 实验方法

1．2．1 ES细胞支持培养

1．2．2 ICA诱导Es细胞分化心肌细胞培养

1．2．3 免疫荧光法检测心肌特异性蛋白α-actinin表达

1．2．4 荧光显微镜检测EBs内ROS水平

1．2．5 Western blot法检测Rac1、Nkx2．5及α-actinin蛋白表达

1．2．6 siRNA转染

1．2．7 Rac1Δ质粒构建与转染

1．2．8 免疫共沉淀

1．2．9 数据分析

1．3 实验结果

1．3．1 细胞形态观察及肌小节结构蛋白α-actinin表达

1．3．2 ICA促ES细胞分化为心肌细胞

1．3．3 ICA对Rac1膜定位的影响

1．3．4 siRNA沉默Rac1对ICA促ES细胞心肌分化的影响

1．3．5 法尼基转移酶抑制剂FTI-277对ICA促ES细胞心肌分化的影响

1．3．6 牛儿基转移酶抑制剂GGTI-298对ICA促ES细胞心肌分化的影响

1．3．7 Rac1 CAAX缺失对ICA促ES细胞心肌分化的影响

1．3．8 Rac1-GTP装填抑制剂NSC23766对ICA促ES细胞心肌分化的影响

1．3．9 ICA对d 5 EBs Rac1-p67phox复合物在细胞膜上共定位的影响

1．4 讨论

1．5 小结

2．miR-126参与VEGF及其受体Flk-1激活介导ICA促ES细胞心肌分化研究

引言

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 仪器

2．1．3 试剂、抗体及耗材

2．2 实验方法

2．2．1 荧光显微镜检测EBs内ROS水平

2．2．2 Western blot

2．2．3 siRNA转染

2．2．4 miRNAs芯检测和实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chajn reaction，qRT-PCR)

2．2．5 miRNA转染

2．2．6 免疫共沉淀

2．2．7 数据分析

2．3 实验结果

2．3．1 VEGF及其受体Flk-1对ICA促ES细胞心肌分化的影响

2．3．2 siRNA沉默Flk-1对ICA促ES细胞心肌分化的影响

2．3．3 miRNAs芯片分析ICA促ES细胞心肌分化过程miRNAs差异表达

2．3．4 miR-126拟似物对ES细胞心肌分化的影响

2．3．5 miR-126抑制剂对ICA促ES细胞心肌分化的影响

2．4 讨论

2．5 小结

3．miR-126-Rac1／p67phox-ROS-Ca2+信号通路在ICA促ES细胞心肌分化中的作用研究

引言

3．1 实验材料

3．1．1 细胞株

3．1．2 仪器

3．1．3 试剂、抗体及耗材

3．2 实验方法

3．2．1 Western blot

3．2．2 miRNA转染

3．2．3 EBs内[Ca2+]i浓度测定

3．2．4 Percoll不连续密度梯度离心法分离ES细胞衍生心肌细胞

3．2．5 ES细胞衍生心肌细胞内钙瞬变测定

3．2．6 数据分析

3．3 实验结果

3．3．1 miR-126抑制剂对ICA促内质网钙调蛋白表达的影响

3．3．2 miR-126抑制剂对ICA促EBs内[Ca2+]i增加的影响

3．3．3 miR-126抑制剂对ES细胞衍生化心肌细胞钙瞬变的影响

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

综述 microRNAs调控干细胞心肌分化研究现状

附录

附录一 代谢性谷氨酸受体5在小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞中的作用研究

附录二 mGluR5-Homer-PIKE-P13K信号通路在ROS介导淫羊藿苷促小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞中的作用研究

作者简历及在读期间所取得的科研成果