本研究创新点
前言
第一部分ICA诱导小鼠的ES细胞体外分化为心肌细胞的有效作用区间研究
一、仪器与试药
二、实验方法
(一)ES细胞支持培养
(二)ES细胞体外分化为心肌细胞培养
(三)ICA诱导ES细胞体外分化为心肌细胞的培养
(四)免疫荧光法检测心肌特异性蛋白表达
(五)Western blot法检测心肌蛋白表达
(六)流式细胞术检测ICA对分化得到心肌细胞数量的影响
三、实验结果
(一)ES细胞及不同分化阶段的细胞形态观察
(二)肌小节结构蛋白α-Actinin和Troponin-T在分化过程中的表达情况
(三)不同时段加入10-7mol/L ICA对心肌分化的影响及最佳作用区间评价
(三)ICA增多了由ES细胞分化得到的心肌数量
四、讨论
五、小结
第二部分活性氧及其调控的MAPK家族在ICA诱导心肌分化中的作用研究
一、仪器与试药
二、实验方法
(一)流式细胞术检测ES细胞内ROS水平
(二)荧光显微镜检测EBs内ROS水平
(三)Western blot法检测NOX4蛋白表达的及p38MAPK,ERK以及JNK磷酸化
(四)利用选择性抑制评价p38MAPK、JNK或ERK通路对心肌分化的影响
(五)RT-PCR法检测心肌特异性基因表达
(六)利用特异性抑制剂评价NADPH酶对心肌分化作用的影响
(七)免疫荧光法检测MEF2C在细胞内分布
三、实验结果
(一)ICA对ES细胞内ROS水平的影响
(四)ICA对EBs内ROS水平的影响
(三)ICA对细胞内NOX4蛋白表达的影响
(四)ICA对细胞内MAPK家族磷酸化水平的影响
(五)选择性抑制p38MAPK、JNK或ERK对ICA诱导分化作用的影响
(六)NADPH酶抑制剂对ICA促分化作用及对p38MAPK磷酸化的影响
(七)ICA对MEF2C在细胞核细胞质分布的调控
四.讨论
五.小结
第三部分ICA对小鼠ES细胞分化为心肌细胞过程中线粒体形成相关蛋白PPARα及其辅激活因子PGC-1α的影响
一、仪器与试药
二、实验方法
(一)RT-PCR法检测心肌发育依赖性基因及PGC-1α、PPARαmRNA表达
(二)Western blot法检测分化过程中PGC-1α和PPARα蛋白表达
(三)免疫荧光原位检测心肌特异性蛋白与PPARα分布
三、实验结果
(一)PCC-1α和PPARαmRNA在分化过程中的表达情况
(二)PGC-1α及PPARα蛋白在分化过程中的表达情况
(五)心肌分化早期PPARα在细胞核及细胞质的分布
(四)选择性抑制PPARα对ES细胞分化为心肌细胞的影响
(五)PPARα激动剂对ES细胞分化为心肌细胞的影响
(六)ICA促进PGC-1α及PPARαmRNA的表达
(七)ICA促进PGC-1α及PPARα的蛋白表达
四、讨论
五、小结
参考文献
综述:调控小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的细胞因子及相关信号通路
发表论文
致谢