黑曲霉糖化酶淀粉结合区环化重排及其对糖化酶生淀粉降解性能的影响

摘要

淀粉酶可以水解普通淀粉，但只有百分之十的淀粉酶可以结合并分解生淀粉。糖化酶(Glucoamylase，GA)是一类具有特殊生淀粉结合能力的淀粉水解酶，该类淀粉酶具有一类重要的结构域，淀粉结合区(Starch-binding Domain，SBD)。SBD具有重要的工业应用价值:在粮食加工和淀粉液化过程中，选择性地去除织物中的淀粉，重组蛋白质的亲和纯化和提高非淀粉分解酶的效率。但是在工业应用中因为发酵过程中糖化酶(GA)的表达量偏低以及杂蛋白的存在，其分离纯化较困难。此外现有的生淀粉降解酶活性不足，需要通过高温蒸煮，经过糊化、糖化过程才能利用生淀粉，造成能量消耗偏大、成本过高。这使得我们迫切需要构建表达量高，分离纯化简单，能耗小且生淀粉降解酶活性较高的重组菌株。
　　蛋白质环化重排是通过共价连接氨基端和羧基端，裂解某个钛键重新获得新的N-末端和C-末端的过程。通过环化重排处理之后能够提高蛋白质催化能力和配体亲和性[86,87]，改变底物选择性[88,89]，改变低聚反应状态[90]和在蛋白水解消化过程中提高稳定性[91]。
　　本研究旨在通过研究黑曲霉糖化酶的SBD结构域环化重排获得不同N-末端后，插入环化重排SBD片段的重组菌株所表达的蛋白质与生淀粉结合性能的变化。另外研究在环化重排SBD片段的影响下，具有不同SBD结构域的黑曲霉糖化酶与生淀粉和普通淀粉亲和性的变化及其酶活性的研究。
　　我们以黑曲霉基因组为模板，扩增得到黑曲霉GA的SBD结构域序列ANG-SBD和糖化酶全长序列ANG。通过随机环化重排获得六种环化突变基因:ANGCP527、ANGCP546、ANGCP559、ANGCP585、ANGCP593和ANGCP605。六种环化突变基因和原始ANG-SBD基因插入质粒pet28a重组获得原核表达体系，经表达纯化后比较不同环化变换突变后的SBD的生淀粉结合性能的差异。同时为比较不同SBD突变对糖化酶生淀粉降解性能的影响，将全长序列ANG插入质粒pPIC9K重组获得毕赤酵母真核表达体系，并用六个环化重排基因替换ANG-SBD-pPIC9K重组质粒的原始SBD结构域序列，构建获得六种整合型分泌表达淀粉酶的重组菌株:CP527，CP546，CP559，CP585，CP593和CP605。
　　结果表明:环化重排菌株CP546、CP559和CP593的生淀粉结合能力和水解比活相对于原始菌株都有较大程度的提高，其中CP546的生淀粉结合能力最强，其生淀粉结合能力是对照组的1.5倍，相对应的CP546纯化后的纯糖化酶液对生淀粉水解性能也最高为5.59IU/mg，对照组是4.51IU/mg，水解比活大概提高20％。CP559和CP593对生淀粉结合能力分别提高27％和33％。而另外两株环化重排菌株CP527，CP585的生淀粉结合能力和水解比活有较大程度的降低，CP605的生淀粉结合能力和生淀粉降解能力变化不大。而环化重排菌株的糖化酶可溶性淀粉水解比活相对于对照组变化不大，保持原来水平基本不变。
　　本课题研究结果表明，SBD结构域环化重排后，其生淀粉结合能力越高相对应的糖化酶生淀粉降解比活就越高，但是环化重排对糖化酶的可溶性淀粉降解能力影响不大。

目录

声明

致谢

摘要

前言

材料与方法

1．实验菌株和质粒

2．培养基

2．1 YPD培养基

2．2 LB培养基

2．3 pet28a原核体系表达培养基

2．4 MD培养基

2．5 发酵表达培养基

3．实验仪器和装置

4．试剂盒、工具酶和化学试剂

4．1 试剂盒

4．2 工具酶

4．3 化学试剂

5．引物设计

5．1 ANG糖化酶基因获得引物

5．2 ANG-SBD基因环化引物

5．3 重组质粒构建验证引物

5．4 ANG-SBD的SBD结构域区域被替代所用引物

6．实验方法与步骤

6．1 黑曲霉糖化酶基因的SBD结构域的环化及SBD-pet28a重组载体的构建

6．2 黑曲霉糖化酶基因毕赤酵母表达载体ANG-SBD-pPIC9K的构建

6．3 六种环化基因替代ANG-SBD-pPIC9K载体的SBD结构域，获得六种重组毕赤酵母表达载体

6．4 pet28a重组菌株的表达实验

6．5 六种环化重组菌株和ANG-SBD-pPIC9K对照菌株表达实验

结果与讨论

1．黑曲霉基因组SBD结构域的环化及六种目的基因的获得

1．1 CPred软件预测环状变换位点

1．2 糖化酶SBD的环化

1．3 SBD-pet28a重组载体的构建和鉴定

2．构建ANG-SBD-pPIC9K毕赤酵母表达载体

2．1 重叠PCR获得糖化酶目的基因

2．2 In-fusion体系的连接

2．3 ANG-SBD-pPIC9K载体的鉴定

3．环化突变基因代替黑曲霉糖化酶基因SBD结构域区域

4．pet28a重组菌株的表达实验结果

4．1 环状变换后不同的SBD片段的纯化

4．2 不同SBD片段对生淀粉结合性能的比较

5． ANGCP-pPIC9K六种重组菌株的表达结果

5．1 毕赤酵母菌株发酵条件优化

5．2 六株环化突变重组菌株和对照菌株的蛋白表达实验结果

全文总结

创新点

展望

文献综述

参考文献

在读期间发表论文和申请专利