饲料果胶对瘤胃微生物菌群结构和微生物蛋白合成影响的研究

摘要

果胶为一类天然高分子化合物，属结构性碳水化合物。苜蓿、羊草、玉米秸以及稻秸等粗饲料中均含有果胶，但以苜蓿中最为丰富。果胶与淀粉虽然同属非纤维性碳水化合物，但发酵特性差异较大。迄今为止有关果胶影响瘤胃发酵、微生物蛋白合成的报道不多，而对果胶影响瘤胃微生物群落结构以及果胶降解菌这类功能微生物的研究与认知更加有限。本研究首先探索的苜蓿日粮与玉米秸日粮下奶牛瘤胃中的差异微生物菌种或菌群，并建立果胶分解菌检测的分子技术，从而获取更多的果胶降解菌信息;然后以湖羊为模式动物，系统研究了以玉米秸为粗饲料的日粮中补充添加果胶对瘤胃发酵、微生物蛋白合成以及微生物菌群结构的影响。
　　一、果胶对瘤胃微生物菌群的影响及果胶菌检测
　　1.饲喂不同果胶含量日粮对奶牛微生物菌群的影响。本试验检测了苜蓿、玉米秸以及羊草三种粗饲料中的果胶含量，依次为9.3％，2.8％和3.7％（干物质基础）。通过454焦磷酸测序技术分析苜蓿日粮与玉米秸日粮下奶牛瘤胃液中的微生物16S rRNA基因，发现Selenomonas和Treponema菌属包括菌株T.saccharophilum是苜蓿日粮下的特有菌群，Selenomonas ruminantium的比例在苜蓿日粮中也有高于玉米秸日粮的趋势，分析发现T.saccharophilum与 S.ruminantium都是降解果胶、淀粉的微生物。
　　2.不同果胶含量粗饲料组合对瘤胃微生物分布的影响。为了验证测序发现的微生物差异是由日粮中果胶或/和淀粉含量差异引起的，本试验分别对苜蓿、玉米秸、果胶、淀粉以及秸秆与果胶、淀粉的组合为底物的体外发酵液中微生物菌群进行PCR-DGGE分析，发现玉米秸与果胶组合的DGGE条带分布与苜蓿组相似度由67.5％增加至72％，而玉米秸与淀粉组合后与苜蓿条带相似度从67.5％降至65％，从微生物学角度证实了果胶是秸秆与苜蓿的重要差异养分之一。对差异条带克隆测序发现了与T.saccharophilum相似度为99％的克隆，进一步证实该菌对果胶降解的特异性。Real-time分析还发现整个Treponema菌属（密螺旋菌菌属）在以淀粉为底物的条件下数量大大降低，而果胶的添加显著促进该菌属的生长(P＜0.05)，提示了以T.saccharophilum为代表的Treponema菌属都与果胶降解密切相关。而S.ruminantium在果胶或淀粉为底物的发酵液中丰度差异不显著。
　　3.果胶分解菌T.saccharophilum实时定量方法构建与体内外丰度检测。由于迄今缺乏准确、可靠的检测方法，T.saccharophilum在瘤胃中的数量未知。因此，本研究设计了能够特异性扩增T.saccharophilum16S rRNA基因的引物，验证结果表明引物灵敏、可靠，可以应用于未来瘤胃生态研究。利用设计的引物进一步从体外、体内角度检测了T.saccharophilum与不同果胶含量粗饲料的关系。体外结果表明T.saccharophilum在苜蓿以及添加果胶的底物中丰度显著高于玉米秸、羊草以及淀粉为底物(P＜0.05)时，而淀粉不支持该菌的生长;体内结果表明T.saccharophilum在苜蓿日粮饲喂的奶牛瘤胃中显著高于羊草、玉米秸以及稻草秸日粮(P＜0.05)。通过对比瘤胃其他细菌的丰度发现，T.saccharophilum在瘤胃中的相对丰度较高，提示了这个菌在瘤胃中重要性，并可能扩展今后与瘤胃中的果胶代谢相关的研究。
　　二、果胶对湖羊生产性能、瘤胃发酵和微生物菌群结构的影响
　　1.果胶对体外瘤胃发酵参数与微生物蛋白合成的影响。为了评估果胶与淀粉对瘤胃发酵的影响，首先进行了体外发酵，以700mg的玉米秸与150mg豆粕为底物的基础上设置4个处理:(1)淀粉150mg+果胶0mg(Pe0)，(2)淀粉100mg+果胶50mg(Pe50)，(3)淀粉50mg+果胶100mg(Pe100)，(4)淀粉0mg+果胶150mg(Pe150)。结果表明，果胶体外发酵速率显著高于淀粉(P＜0.05)，尤其是6h前的早期发酵，此外24h总产气量果胶也显著高于淀粉(P＜0.05)。果胶为底物的发酵属于乙酸型，而淀粉发酵属于丙酸型，本试验中乙丙比随着果胶的增加而线性增加。Pe0与Pe50的pH值低于Pe100和Pe150(P＜0.05)，P150的MCP产量显著高于Pe0（P＜0.05），提示果胶可优化发酵速率、pH等瘤胃发酵参数，并促进微生物蛋白合成。
　　2.果胶对湖羊生长性能和瘤胃发酵的影响。为了深入研究果胶对反刍动物生产性能的影响，本试验选取45只健康无病的7月龄公湖羊，按照随机区组设计和同栏大小相近原则，根据体重分为5个处理:基础日粮（精粗比50∶50的全混合日粮）为对照组（Ctrl），在基础日粮上分别添加2.5％和5％果胶的低果胶日粮(PeL)和高果胶日粮(PeH)，分别添加2.5％和5％淀粉的低淀粉日粮(StL)和高淀粉日粮(StH)。结果发现，添加果胶可以增加采食量，而添加淀粉则线性降低采食量(P＜0.05)。日粮PeH的MCP产量在各组中最高(P＜0.05)，且果胶的添加对MCP的生成有线性增加效应(P＜0.01)，而淀粉的添加则对MCP产量具有曲线降低效应，即高淀粉日粮反而抑制了MCP的合成。果胶添加线性增加日增重（P＜0.05），PeH在各组中日增重最高(P＜0.05)，与其MCP合成量一致。此外，饲喂Pe日粮可显著降低血清中甘油三脂(TG)水平(P＜0.05)。这些结果表明，与淀粉相比，添加果胶有助于瘤胃微生物蛋白合成，改善湖羊的生产性能。
　　3.果胶对湖羊瘤胃微生物菌群结构的影响。为了深入研究与果胶降解相关的瘤胃细菌，采用Real-time以及Miseq高通量测序，深度分析上述试验中各组日粮下湖羊瘤胃微生物菌群分布情况。经过菌门、菌科、菌属以及OTU水平的多重比较分析，证实日粮中添加果胶形成的微生物分布与对照或淀粉处理组有显著差异。实时定量结果表明，瘤胃已知的典型微生物中除了Treponema以及T.saccharophilum被果胶富集，多数菌偏好淀粉利用。然而，通过高通量测序发现，果胶的添加主要富集了厚壁菌门的微生物成员，这些相关微生物多数为未培养或者尚未有特异引物能够准确定量的微生物，包括该门类下梭菌纲下的Mogibacteriaceae科和Lachnospiraceae（毛螺菌科）以及Erysipelotrichi（产芽胞菌纲）下产芽胞菌科的成员。其中毛螺菌科下Butyrivibrio（丁酸弧菌属）、Coprococcus（粪球菌属）、Moryella以及一未分类属，产芽胞菌科下Holdemania（霍尔德曼氏菌属）、L7A_E11以及Bulleidia属都表现出显著的果胶特异性。
　　综上所述，作为结构性碳水化合物的日粮果胶，其营养效果优于淀粉，能促进瘤胃微生物蛋白合成，进而提高动物生产性能。日粮果胶还可促进瘤胃中Treponema菌属、厚壁菌门微生物的生长，提示这些菌群可能是高果胶含量日粮下参与微生物蛋白生成的关键菌群。

目录

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致谢

表目录

图目录

英文缩略表

摘要

第一章 文献综述

第一节 饲料果胶及其营养意义

1 饲料中果胶含量

2 果胶的特性与结构

3 果胶的营养作用

第二节 瘤胃果胶降解菌及其研究手段

1 基于纯培养手段的瘤胃果胶降解首研究

2 分子生物学手段在瘤胃微生物研究的应用

第三节 微生物蛋白合成的营养调控

1 微生物蛋白对反刍动物的重要性

2 影响微生物蛋白合成的因素

第四节 本研究的目的、意义和内容

1 本研究的目的和意义

2 研究内容

第二章 果胶对瘤胃微生物菌群影响及果胶菌检测

第一节 饲喂不同果胶含量日粮奶牛的微生物菌群分析

1 材料与方法

2 试验结呆

3 讨论

4 小结

第二节 不同果胶含量粗饲料组合发酵对瘤胃微生物菌群的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三节 果胶分解菌Treponema saccharophilum实时定量方法构建与体内外丰度检测

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三章 果胶对湖羊生产性能、瘤胃发酵和微生物菌群结构的影响

第一节 果胶对体外瘤胃发酵参数与微生物蛋白合成的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第二节 果胶对潮羊生长性能和瘤胃发酵的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第三节 果胶对湖羊瘤胃微生物茵群结构的影响

1 材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4 小结

第四章 综合讨论

第一节 果胶对瘤胃微生物茵群结构的影响

第二节 果胶对瘤胃MCP合成的影响

提示、创新点及后续研究展望

附录

附录一 微生物基因组DNA提取纯化的RBB+C法

附录二 体外发酵厌氧培养基配制方法

附录三 克隆的制备

附录四 瘤胃微生物实时定量PCR引物

附录五 Miseq测序引物

参考文献

个人简历