大肠杆菌体内和体外表达HIV-1 gp41重组抗原及其免疫反应性检测

摘要

近年来，HIV病毒在全球范围内呈现快速流行态势。HIV抗体诊断试剂作为目前初步诊断HIV的主要方法，具有巨大的市场价值。随着生物技术的发展，利用基因工程的手段，制备具有良好免疫反应性的HIV-1 gp41重组抗原原料，对于HIV抗体诊断试剂的研发有着深远意义。
　　本文首先合成了经过密码子优化的gp41基因质粒模板pET-28a(+)-gp41，PCR扩增获得了包含gp41主要优势抗原表位以及膜外重要结构域(NHR、CHR、MPER)的截短基因序列。通过在gp41截短片段上游添加亲水性分子伴侣DsbA，在大肠杆菌体内实现了gp41优势抗原表位蛋白的融合表达。在优化表达条件下（37℃，0.2 mM IPTG，诱导后培养时间10h），融合蛋白表达水平为8.7μg/mL。
　　鉴于gp41融合蛋白在大肠杆菌体内表达的水平较低，无法满足制备gp41抗原的要求，本研究进而利用大肠杆菌体外无细胞体系表达gp41蛋白。利用PCR克隆gp41全长基因，成功构建无细胞表达重组质粒pIVEX2.4c-gp41，在大肠杆菌无细胞体系中实现了gp41全长蛋白的表达。进一步考察去污剂重悬目标蛋白和直接在无细胞体系中添加去污剂两种模式对获得可溶gp41蛋白的影响。结果显示，所尝试的各种去污剂均不能有效重悬gp41蛋白沉淀;而直接添加去污剂模式在最优条件下（添加终浓度为0.2％的Brij78），可溶gp41蛋白的表达水平达到650μg/mL。
　　对添加去污剂模式所表达的可溶gp41重组蛋白进行纯化、浓缩和替换缓冲液，蛋白纯度达到95.6％，浓度为1.5 mg/mL，总回收率为70％。利用纯化后的gp41重组蛋白制备乳胶法免疫层析试纸，通过对不同抗体滴度HIV-1阳性标本、HIV-1阴性标本、TP阳性标本以及HBeAb阳性标本的检测，证明该gp41重组蛋白免疫反应性良好。
　　总之，本文致力于HIV-1 gp41在大肠杆菌体内和体外无细胞体系的重组表达研究。通过对无细胞表达体系的优化，实现了gp41的全长可溶表达，亲和纯化获得的目标蛋白经乳胶法试纸评估具有免疫反应性。本研究为HIV抗体诊断试剂的研发提供了具有潜在应用价值的gp41抗原。

目录

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论文说明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 人类免疫缺陷病毒HIV

1．2．1 HIV的发现

1．2．2 HIV的形态结构

1．2．3 HIV的基因组结构

1．2．4 HIV入侵细胞的机制和致病机理

1．2．5 HIV的分型及分布

1．2．6 全球艾滋病流行现状

1．3 HIV-1跨膜蛋白gp41

1．3．1 HIV-1 gp41的结构和功能

1．3．2 HIV-1 gp41的抗原表位

1．3．3 gp41在HIV诊断检测中的应用

1．4 膜蛋白表达研究的策略

1．4．1 体内融合表达策略

1．4．2 体外无细胞体系表达策略

1．5 本课题的基本思路和研究内容

第二 章材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 质粒

2．1．3 主要试剂及工具酶

2．1．4 培养基

2．1．5 分子生物学实验溶液配制

2．1．6 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 分子克隆实验

2．2．2 细胞密度的测定

2．2．3 SDS-PAGE电泳

2．2．4 Western bloning分析

2．2．5 大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备

第三章 HIV-1 gp41在大肠杆菌体内的截短融合表达

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株与质粒

3．2．2 试剂及工具酶

3．3 实验方法

3．3．1 模板合成及目的基因选择

3．3．2 引物设计

3．3．3 PCR扩增目的基因

3．3．4 融合表达载体的构建

3．3．5 大肠杆菌体系诱导表达gp41融合蛋白

3．3．6 细胞破碎

3．3．7 SDS-PAGE与Wbstern blotting

3．4 结果与讨论

3．4．1 gp41截短基因的扩增

3．4．2 pET-39b(+)-gp41-T融合表达载体的构建

3．4．3 gp41融合蛋白的诱导表达

3．4．4 诱导温度对gp41融合蛋白表达的影响

3．4．5 IPTG浓度对gp41融合蛋白表达的影响

3．4．6 诱导后培养时间对gp41融合蛋白表达的影响

3．5 本章小结

第四章HIV-1 gp4l在大肠杆菌体外无细胞体系的高效表达

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株与质粒

4．2．2 试剂及工具酶

4．3 验方法

4．3．1 引物设计

4．3．2 目的基因的克隆

4．3．3 无细胞重组表达载体的构建

4．3．4 制备大肠杆菌无细胞体系抽提物

4．3．5 大肠杆菌无细胞反应体系配置

4．3．6 无细胞体系表达gp41

4．3．7 去污剂重悬无细胞体系表达的膜蛋白沉淀(P-CF模式)

4．3．8 无细胞体系添加去污剂可溶表达gp41(D-CF模式)

4．3．9 SDS-PAGE

4．4 结果与讨论

4．4．1 gp41全长基因的克隆

4．4．2 pIVEX2-4c-gp41无细胞表达载体的构建

4．4．3 gp41蛋白的无细胞体系表达

4．4．4 去污剂重悬表达可溶性gp41

4．4．5 直接在无细胞体系添加去污剂表达可溶性gp41

4．4．6 Brij78浓度对无细胞体系可溶性表达gp41的影响

4．4．7 反应时间对无细胞体系可溶表达gp41的影响

4．4．8 无细胞体系两种表达可溶性gp41模式的比较

4．5 本章小结

第五章 gp41重组蛋白的分离纯化及其免疫反应性的初步检测

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 质粒

5．2．2 试剂

5．3 实验方法

5．3．1 可溶性gp41的制备表达

5．3．2 Ni-NTA亲和层析纯化gp41

5．3．3 纯化后蛋白的浓缩和缓冲液替换

5．3．4 蛋白浓度的测定

5．3．5 SDS-PAGE

5．3．6 乳胶法试纸的制备

5．3．7 gp41重组蛋白的反应性检测

5．3．8 gp41重组蛋白的灵敏度检测

5．3．9 gp41重组蛋白的特异性检测

5．4 结果与讨论

5．4．1 gp4l重组蛋白的纯化

5．4．2 gp41重组蛋白的浓缩和替换缓冲液

5．4．3 gp41重组蛋白的反应性检测

5．4．4 gp41重组蛋白的灵敏度检测

5．4．5 gp41重组蛋白的特异性检测

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

作者简介