绵羊细粒棘球蚴病病理组织学观察及EG95重组抗原体外表达研究

摘要

细粒棘球蚴病(Echinococcosis)又称囊性包虫病(cysticechinococcosis，CE)，是由处于细粒棘球绦虫的幼虫(续绦期)寄生于人体或某些动物体内引起的人畜共患寄生虫病，该病对人畜危害极为严重。细粒棘球蚴病呈全球性分布，主要在牧区、农牧区流行，中国是该病的高发区。细粒棘球蚴病在我国的甘肃、新疆、宁夏、内蒙古、青海、四川、陕西、西藏等西部、西北部省份尤为严重。该病严重威胁牛、羊等家畜以及人的身体健康，导致动物生产性能严重下降，使我国畜牧业每年直接经济损失高达30多亿元，是中国西部和西北部最严重的公共健康问题之一。目前对该病的控制主要以犬驱虫和对牧民的预防教育等综合性防制措施为主，但因种种因素限制，此举措未获得理想效果。通过疫苗预防将是控制该病的理想途径之一。现代分子生物学、生物化学和免疫学新技术的发展及其在寄生虫病疫苗研究中的应用，使棘球蚴病疫苗的研制取得了重大进展，基因工程重组抗原疫苗具有极大的应用价值。众多研究表明，EG95蛋白是目前发现的最具保护作用的抗原，EG95重组基因疫苗也是近年来的研究热点。
　　 从青海省某屠宰场搜集患细粒棘球蚴病绵羊，观察内脏器官病变，取寄生虫包囊及其周围肝脏、肺脏组织，进行石蜡切片、HE染色，进行组织病变观察。结果显示，细粒棘球蚴包囊的组织学结构具有典型的寄生虫肉芽肿特征；内侧为红染的板层状结构；外侧为特殊肉芽层，主要由上皮样细胞构成，可见多核巨细胞和少量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润；而包囊壁最外层则由成纤维细胞及胶原纤维组成，其中有大量淋巴细胞浸润。包囊的形成对器官造成的损伤是多方面的，除包囊占位性病变造成的组织压迫性萎缩外，并见肝脏间质结缔组织及胆管大量增生造成肝硬变，肝脏急性变性、过敏性炎症等损伤性反应。肺脏可见间质增生炎症及囊液外渗引起的过敏性炎症反应。
　　 从细粒棘球蚴病病羊的肝脏以及肺脏分离包囊，抽取囊液，离心取沉淀，分离基因组DNA，用PCR方法扩增NADH脱氢酶亚基1(ND1)基因并测序。通过GenBank中BLAST分析，结果显示所获ND1序列与细粒棘球绦虫(G1基因型)ND1序列相似性达99.9％，确定该地区流行的细粒棘球蚴为G1基因型，此法可用于细粒棘球蚴基因型的快速判定。
　　 取包囊囊液，沉淀原头蚴，提取总RNA，利用RT-PCR技术从细粒棘球蚴中扩增了EG95基因cDNA，构建了重组克隆载体pGEM-T-EG95cDNA，转化E.coliJM109感受态细胞，经抗生素筛选获得重组子并测序，结果发现EG95基因cDNA序列与Genebank中公布的EG95基因cDNA序列(AY421719)编码区未出现碱基差异，因而编码的氨基酸未发生改变。
　　 通过一系列预测分析软件对EG95基因以及蛋白的相关特性及抗原表位加以预测分析，同时根据分析结果设计引物进行信号肽和疏水区的切除。分别用全长的EG95cDNA、切去信号肽和疏水区的EG95s构建不同的重组表达载体。在E.coliRosetta(DE3)中诱导表达了预期大小的目的蛋白，其中既有以包涵体形式表达的EG95蛋白也有以可溶形式表达的EG95蛋白。
　　 将表达蛋白进行处理后进行SDS-PAGE，然后进行Western-blot检测，结果表明表达蛋白具有良好的抗原特异性。该蛋白的成功表达，为细粒棘球蚴基因工程疫苗的开发生产奠定了基础。