经鼻吸入胰岛素对阿尔茨海默病的作用以及机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年期痴呆最常见的病因，主要特点是进行性的认知和行为功能的损害。尽管全世界很多科学家都在致力于研究AD的病因，发病机制以及治疗方法，但目前仍然没有有效的可以治疗或者使疾病停止恶化的药物。
　　有研究发现AD脑内存在胰岛素信号通路的缺陷，AD病人脑中胰岛素受体(insulin receptor,IR)的表达和结合能力都有异常。而且用淀粉样蛋白(amyloidbeta，Aβ)寡聚体可以通过降低神经元表面的IR或与胰岛素竞争受体的方式阻断胰岛素信号通路向细胞内的传递。目前认为AD的胰岛素信号通路缺陷可能与散发性AD的发生相关。小范围的临床试验表明经鼻吸入胰岛素不仅可以改善健康受试者的注意力和记忆水平，对轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)和AD病人的记忆也有改善作用。但是胰岛素究竟是如何在AD病人的脑中发挥作用从而改善认知功能的分子机制目前仍然不清楚。
　　我们前期的研究发现，对9月龄的三转基因AD小鼠(3xTg-AD mice)经鼻吸入胰岛素治疗1周后，可以修复胰岛素信号通路的缺陷，增加脑内突触蛋白的水平，降低脑内Aβ40的含量，减少脑内小胶质细胞的激活。为了更进一步地研究经鼻吸入胰岛素对早期AD病理改变的影响，我们采用4.5月龄的APP/PS1双转基因AD小鼠模型（APPswe/PS1dE9，APP/PS1），经鼻吸入胰岛素1U/天给药6周后，对AD模型小鼠的基本生理状况，行为学，分子生物学等进行了一系列的探索，主要的研究方法和结果如下:
　　1.我们将所有的小鼠分成三组:APP/PS1胰岛素组(APP/PS1-ins)，APP/PS1生理盐水组（APP/PS1-veh）和野生型生理盐水组(WT-veh)。给药前和给药后每周对这些小鼠监测体重，发现给胰岛素组与给生理盐水对照组以及非转基因小鼠相比体重的变化无明显差异。
　　2.连续给药6周后，为评估三组小鼠的焦虑状态以及认知功能的情况，我们做了旷场实验(Open Field，OF)和水迷宫测试（Morris Water Maze，MWM）。APP/PS1小鼠与WT小鼠比焦虑水平增高，经鼻吸入胰岛素后能降低该组小鼠的焦虑状态到WT小鼠的水平;在MWM实验的获得性训练(Acquisition Phase)阶段，三组小鼠的逃避潜伏期(Escape latency)和从入水点到平台的游泳距离(Pathlength to platform)无显著差异;在探查测验阶段，各组小鼠在原来平台所在象限所花的时间百分比也没有显著差别，这些结果表明6月龄的APP/PS1小鼠的认知功能在水迷宫测试中还未表现出明显的损害。但在反向迷宫实验(ReverseMorris Water Maze，rMWM)中，APP/PS1-veh小鼠的逃避潜伏期和游泳距离都比野生小鼠升高，胰岛素给药后有改善，提示APP/PS1小鼠已经表现出了记忆行为的可塑性异常，胰岛素对此有一定改善作用。
　　3.免疫印迹方法分析三组小鼠的海马组织中胰岛素信号通路相关蛋白的表达水平，APP/PS1小鼠海马胰岛素信号通路相关蛋白的表达异常，经鼻吸入胰岛素可以改善这些蛋白表达的异常。与此结果相对应，c-Jun N-terminal kinase（JNK），这个在胰岛素抵抗和AD的病理学中发挥重要作用的激酶在APP/PS1小鼠海马中表达升高，经鼻吸入胰岛素降低JNK蛋白的磷酸化水平。
　　4.免疫组化分析APP/PS1小鼠脑内的淀粉样蛋白斑块(Amyloidβplaque，Aβ plaque)的沉积，APP/PS1脑内存在明显的斑块沉积，统计分析提示经鼻吸入胰岛素可以减少APP/PS1小鼠皮层和海马的淀粉样斑块数量和面积。斑点印记(Dotblotting)实验发现经鼻吸入胰岛素减轻APP/PS1小鼠海马可溶性Aβ寡聚体的含量。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）结果显示胰岛素可以降低APP/PS1小鼠海马可溶性Aβ40 and Aβ42的水平。
　　5.为了进一步研究胰岛素是否影响蛋白淀粉样前体蛋白(Amyloid precursorprotein，APP)的剪切或影响APP蛋白的磷酸化从而使Aβ的量发生变化，我们对APP蛋白的磷酸化水平以及APP加工过程中的中间产物做了免疫印迹分析。统计分析表明经鼻吸入胰岛素增加海马sAPPα的含量，减少sAPPβ的含量，并且使CTFβ/CTFα的比例下降，但不影响APP磷酸化蛋白的水平。
　　6.APP的剪切和Aβ的代谢过程中有许多酶的参与，包括β位点APP剪切酶1(Beta-secretase1，BACE1)，主要的α位点剪切酶ADAM10，以及与Aβ的降解和清除有关的IDE，APOE和LRP1等，APP/PS1小鼠海马BACE1和APOE水平与野生型小鼠相比升高，经鼻吸入胰岛素降低BACE1和APOE的表达水平，升高ADAM10的表达，但对IDE和LRP1没有明显影响。
　　7.APP/PS1小鼠脑内星型胶质细胞和小胶质细胞的标志蛋白表达均增加，但没有发现胰岛素对此有明显的改善作用。与突触相关的三个蛋白突触前蛋白Synaptophysin，突触后密度蛋白95 PSD-95，神经突触素1Synapsin1在三组小鼠脑中的表达水平无显著差异。
　　8.6月龄APP/PS1小鼠海马Tau蛋白，磷酸化Tau蛋白的水平无明显异常;对与Tau磷酸化相关的几个激酶的免疫印迹分析也没有发现表达水平的异常。
　　9.胰岛素增加APP/PS1小鼠海马内主要的神经元发生标志蛋白doublecortin的水平。
　　终上所述，6月龄的APP/PS1转基因小鼠在水迷宫实验中虽然未表现出明显的认知功能障碍，但在反向迷宫测试中已经表现出了记忆可塑性的损害，经鼻吸入胰岛素对此有改善作用。APP/PS1小鼠焦虑水平升高，吸入胰岛素可缓解小鼠的焦虑水平。对小鼠海马的生化分析显示APP/PS1小鼠脑内胰岛素信号通路存在异常，胰岛素部分改善该信号通路的异常，可能与胰岛素能减轻小鼠脑内的JNK蛋白激活有关。转基因小鼠海马可溶性的Aβ40和Aβ42水平，可溶性Aβ寡聚体的含量，以及脑内淀粉样斑块的沉积均表现出不同程度的升高。吸入胰岛素后改善了脑内的Aβ病理变化。进一步的研究发现胰岛素可能是通过调节APP蛋白的剪切加工，使APP蛋白的剪切更多地朝着不产生Aβ的途径进行，并恢复脑内升高的APOE蛋白水平来减轻Aβ病理变化。经鼻吸入胰岛素还对脑内神经元的发生有促进作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1．引言

2．经鼻吸入胰岛素对APP／PS1小鼠焦虑相关行为和认知行为的影响

2．1 研究背景

2．2 材料与实验试剂

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 小结

3．经鼻吸入胰岛素改善APP／PS1小鼠脑内胰岛素信号通路异常

3．1 研究背景

3．2 材料与实验试剂

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．1 小结

4．经鼻吸入胰岛素降低APP／PS1小鼠脑内淀粉样斑块沉积，可溶性Aβ单体和寡聚体含量

4．1 实验器材和试剂

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 小结

5．经鼻吸入胰岛素影响APP／PS1小鼠脑内APP的剪切加工，也影响参与APP剪切加工与Aβ代谢的蛋白的表达

5．1 实验背景

5．2 实验材料与方法

5．3 实验结果

5．4 小结

6．经鼻吸入胰岛素对APP／PS1小鼠脑内炎性细胞和突触蛋白以及Tau蛋白磷酸化无显著影响

6．1 实验材料与方法

6．2 实验结果

6．3 小结

7．经鼻吸入胰岛素增加APP／PS1小鼠脑内神经元再生

7．1 实验材料与方法

7．2 实验结果

7．3 小结

8．讨论与结论

9．创新性与展望

参考文献

综述

作者简历及科研成果