稻米溶血磷脂的鉴定、遗传多样性及其与品质的关系研究

摘要

稻米中的功能性脂质具有改善稻米品质及人类健康的重要功能，近年来逐渐受到广泛关注。然而，磷脂这类具有重要营养价值的稻米脂质，由于测定技术的制约，至今不曾被充分开发利用。稻米胚乳中磷脂的溶血形式-溶血磷脂(LPLs)能与淀粉结合形成直链淀粉-脂质复合物，从而显著影响稻米食用品质及淀粉特性。虽已有研究明确了稻米胚乳中LPLs的变异范围，但全面的LPLs谱分析、基因型×环境互作对LPLs积累的影响、LPLs与稻米食用品质关系、LPLs与磷素代谢关系等基础研究依然欠缺。阐明稻米LPLs的积累规律、遗传控制及其调控机理，对稻米品质改良与消费指导具有重要意义。因此，有必要详细鉴定稻米磷脂组分及其变异规律并解析其遗传机理，为今后发掘、选育符合消费者需求和食品安全的高营养价值新品种提供理论依据。本研究围绕稻米淀粉磷脂展开，建立了一种快速、高效的用于提取并定量测定稻米LPLs含量的方法。同时，开展了稻米中LPLs的遗传多样性及其与稻米淀粉特性、水稻籽粒磷代谢的潜在关系研究。主要结果总结如下:
　　1.建立了一种水溶性正丙醇提取，结合液相色谱-质谱（HPLC-MS）用于一步测定稻米淀粉LPLs的方法。结果表明，不同稻米碾磨方法对于淀粉LPLs的提取及最终测定结果影响较小。用75％正丙醇(8 mL/0.15 g)在100℃下加热2h来提取LPLs的简单一步法与复杂多步法的提取效果相近。优化了HPLC-MS检测方法，能在15 min中同时鉴定到10种主要的淀粉LPLs成分。该方法需样量低，可用于大规模水稻样品的淀粉总LPLs及其组分的定量分析，也可用于其他作物的淀粉LPLs分析。
　　2.稻米中淀粉LPLs各组分含量在20份水稻品种中显著不同，表明稻米淀粉LPLs具有广泛的遗传多样性。稻米淀粉LPLs的主要成分是溶血磷脂酰胆碱(LPC)16∶0（3009.7-4697.8μg/g）、LPC18∶2（836.6-2182.3μg/g）和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)16∶0（625.7-1139.8μg/g）、LPE18∶2（170.6-481.6μg/g）。总溶血磷脂酰胆碱、总磷脂酰乙醇胺和总溶血磷脂含量分别为4727.1-7685.2μg/g，882.8-1809.5μg/g，5609.8-9401.1μg/g。尽管方差分析表明环境和基因型-环境互作对LPLs积累具有显著影响，但这两种效应分别仅占总变异的0.7-38.9％和1.8-6.6％。相关性分析发现，LPC14∶0与LPE14∶0，LPC16∶0与LPE16∶0，LPC18∶1与LPE18∶1，LPC18∶2与LPE18∶2，LPC18∶3与LPE18∶3呈显著正相关，表明LPLs在合成过程中可能是先合成脂肪酸链再连接一定比例的氨基醇。聚类分析表明，20份水稻能被分为三类，而主成分分析同样表明这些水稻可分为三类，其中第一、二成分能分别解释57.7％和16.2％的总变异。初步关联分析共鉴定到22个控制LPLs合成的可能相关位点（P＜0.001），分布于除第3和7染色体外所有染色体。初步找到可能的淀粉磷脂合成相关基因3个，重新测定了这些基因的序列，设计了基因标签标记，为进一步研究稻米淀粉LPLs代谢及遗传分析提供候选基因。
　　3.稻米的糊化特性和热学特性是稻米蒸煮食用品质和工业应用的重要评价指标，分析了稻米LPLs各组分与糊化特性和热学特性的相关关系。结果表明，冷胶粘度(CPV)、崩解值(BD)、回复值(CS)等糊化特性与LPLs存在显著相关性。除焓变外，热学特性一般与LPLs无显著相关性。通过偏相关分析排除表观直链淀粉含量（AAC）的影响后，发现CPV与个别LPLs组分仍然存在显著正相关，BD、CS和个别LPLs组分仍然呈显著负相关。这些结果表明，稻米淀粉LPLs能以独立的或与直链淀粉结合的方式，影响稻米糊化特性。
　　4.提高磷素(P)吸收和利用效率有助于改善稻米营养与品质，然而水稻籽粒中磷素运输与分配的分子机理尚不清晰。利用5份低植酸水稻（low phytic acid,lpa）突变体来探究水稻种子中植酸、溶血磷脂等主要的含磷化合物及无机磷的变化。结果表明，lpa突变体的植酸、植酸磷含量显著降低，而无机磷含量明显升高。OsST和OsMIK基因突变导致水稻籽粒中个别LPLs组分和相应的溶血磷脂-磷含量(LPL-P)显著减少。与之相反，OsMRP5和Os2-PGK基因突变则引起除LPC14∶0外，其他LPLs组分及相应的LPL-P含量显著增加。以KBNT-lpa和嘉禾218杂交后代9个株系为材料，用于验证Os2-PGK基因对LPLs合成与积累的影响。结果证明，9个株系中lpa突变体的总溶血磷脂含量仍然高于正常株系的含量。该结果表明，水稻植酸和磷脂的生物合成过程存在某种交互联系，而这种联系很可能是通过籽粒中无机磷的分配与再分配来实现的。

目录

论文说明

声明

Acknowledgements

摘要

Abstract

Contents

List of Figures

List of Tables

Abbreviation

Chapter 1 Literature Review

1．1 Introduction

1．2 Lipids in rice

1．2．1 Lipids in rice bran

1．2．2 Lipids in rice endosperm

1．3 Classification and composition of rice phospholipids

1．4 Environmental influence on rice grain lipids

1．5 Roles of rice lipids

1．5．1 Lipids and grain storage

1．5．2 Lipids and health benefits

1．6 Starch inclusion complex：formation，feature and function

1．6．1 Amylose complexed with lipid

1．6．2 Amylopectin complexed with lipids

1．6．4 Effects of amylose-lipids complex on starch properties

1．7 Application of amyiose ligand complex

1．7．1 PharmaceutieaI and biomedicine industry

1．7．2 Food industry

1．8 Contents and significances of this study

Chapter 2 Determination of Starch Lysophospholipids in Rice Using HPLC-MS

2．1 Introduction

2．2 Materials and methods

2．2．1 Plant materials，reagents and standards

2．2．2 Sample grinding and amylose content determination

2．2．3 Multi-step extractions

2．2．4 Single-step extraction

2．2．5 HPLC-MS analysis

2．2．6 Quantification of starch LPLs

2．2．7 Statistical analysis

2．3 Results and discussion

2．3．1 Sample grinding and multi-step extraction

2．3．2 HPLC-MS analysis of lipids extracted from multi-step extraction

2．3．3 HPLC-MS quantification of LPLs

2．3．4 Total starch LPLs by multi-step extraction

2．3．5 Individual starch LPLs by multi-step extraction

2．3．6 Increase sample throughput by single-step extraction method

Chapter 3 Genotypic Variation in Rice Grain Starch Lysophospholipids

3．1 Introduction

3．2 Materials and methods

3．2．1 Plant materials

3．2．2 Chemicals

3．2．3 Starch phospholipid extraction

3．2．4 Determination of starch LPLs by HPLC-MS

3．2．5 Genotype data and association mapping

3．2．6 DNA extraction，primers design，PCR and sequencing

3．2．7 Statistical analysis

3．3 Results

3．3．1 Rice starch lysophosphatidylcholine

3．3．2 Rice starch lysophosphatidylethanolamine

3．3．4 Rice starch total LPLs

3．3．5 Correlation analysis of starch LPLs

3．3．6 Cluster analysis of starch LPLs

3．3．7 Association test

3．3．8 Sequencing，primer design and genotyping via enzyme digestion

3．4 Discussion

Chapter 4 Contribution of LPLs to Pasting and Thermal Properties of Nonwaxy Rice

4．1 Introduction

4．2 Materials and methods

4．2．1 Materials

4．2．2 Pasting viscosities

4．2．3 Thermal properties

4．2．4 Rice endosperm LPLs

4．2．5 Stafistical analysis

4．3 Results

4．3．1 Set 1：Pasting and thermal properties

4．3．2 Set 1：Relationship between physicochemical properties and LPLs

4．3．3 Set 2：Thermal properties

4．3．4 Set 2：Relationship between rice flour physicochemical properties and LPLs

4．3．5 Set 1 and Set 2 combined：relationship between rice flour physicochemical properties and LPLs

4．4 Discussion

Chapter 5 Alteration of Grain Phospholipid Profiles in Low Phytic Acid Rice Mutants

5．1 Introduction

5．2 Materials and methods

5．2．1 Plant materials

5．2．2 Determination of phytic acid content

5．2．3 Determination of inorganic phosphorus content

5．2．4 Determination of starch phospholipids extraction and HPLC-MS

5．2．5 Determination of fice apparent amylose content and RVA pasting viscosities

5．2．6 Genotyping by molecular markers

5．2．7 Extraction，western blotting and quantification of GBSSI protein

5．2．8 Statistical analysis

5．3 Results

5．3．1 Phytic acids and phosphorus content in LPA rice

5．3．2 Endosperm LPLs in LPA rice

5．3．3 LPLs in breeding lines

5．4 Discussion

Chapter 6 Summary and Prospect

Reference

作者简介

参加科研项目情况

读研期间论文发表情况