ICAM-1单克隆抗体修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体的急性肺损伤靶向治疗研究

摘要

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种临床常见危重症，迄今仍无有效治疗手段。肺血管内皮损伤是诱发ALI的重要原因。研究显示他汀类药物具有保护血管内皮及抗炎的特性，对ALI起到潜在的改善作用。同时研究表明，高剂量他汀干预对其体内抗炎作用具有重要意义，但同时也提高了药物潜在的剂量依赖性副作用的发生风险。本论文以辛伐他汀（simvastatin，SV）为模型药物，构建针对肺血管内皮上细胞间粘附分子1（intercellular adhesion molecule1，ICAM-1）特异性靶向的ICAM-1单克隆抗体修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体(nanostructuredlipid carriers，NLCs)，通过促进药物的病变肺部有效蓄积，在提高药物疗效的同时，降低药物潜在的副作用。
　　采用单硬脂酸甘油酯为固态脂质、中链脂肪酸甘油酯为液态脂质、聚乙二醇单硬脂酸酯为两亲性脂质材料，通过控制脂质材料总浓度，以水性溶剂扩散法制备了不同粒径的空白纳米结构脂质载体NLCs-1(1mg/mL)，NLCs-2(3mg/mL)和NLCs-3(9mg/mL)。制备得到的NLCs粒径分别约43.3nm、85.3nm和198.3nm，随着脂质材料总浓度增加，NLCs粒径增大。以Balb/c小鼠为模型动物，考察空白NLCs的体内分布，结果表明大粒径NLCs具有显著的肺分布优势。
　　控制空白NLCs处方不变，加入质量分数占处方含量5％的模型药物辛伐他汀，通过控制脂质材料与药物总浓度，以水性溶剂扩散法制备了不同粒径的载药纳米结构脂质载体SV/NLCs-1（1mg/mL），SV/NLCs-2(3mg/mL)和SV/NLCs-3(9mg/mL)。制备得到的载药NLCs粒径分别约143.7nm、259.6nm和337.8nm。相比于空白NLCs，包载药物后NLCs粒径增大，同时其粒径同样随着脂质材料与药物总浓度增加而增大。载药NLCs的药物包封率随着脂质材料和药物总浓度增加，由66.70％提高至91.04％。体外释放结果表明，NLCs对药物有缓释作用，药物可持续释放36h以上，且释放速率随着粒径增大而减缓。
　　以人血管内皮细胞株（human vascular endothelial cell line，EAhy926）为模型细胞，考察空白NLCs和载药NLCs的细胞毒性。空白NLCs的细胞半数致死量(IC50)在400μg/mL以上，载药NLCs的IC50在220μg/mL以上，IC50值均随着粒径增大而增大。载药NLCs在模型细胞上的摄取具有时间依赖性，且呈现良好的内在化能力，摄取速率随着粒径增大而减慢。
　　合成单氨基终端的聚乙二醇单硬脂酸酯(NH2-PEG2000-SA)作为两亲性脂质材料，部分替代NLCs原处方中的聚乙二醇单硬脂酸酯。采用水性溶剂扩散法，制备NH2-PEG2000-SA修饰的脂质材料与药物总浓度为9mg/mL的载药NLCs(SV/NLCs-3)。以N，N'-琥珀酰亚胺基碳酸酯为链桥，制备ICAM-1单抗修饰的载药纳米结构脂质载体（anti-ICAM/SV/NLCs）。Anti-ICAM/SV/NLCs粒径约354.7nm，电位约-32.1mV，药物包封率约96.78％，体外药物释放可持续36 h以上，与未经抗体修饰的SV/NLCs-3相比理化性质无明显变化。以LPS活化的EAhy926为细胞模型考察纳米粒定量摄取，结果表明细胞对anti-ICAM/SV/NLCs的摄取高于对照SV/NLCs-3;采用ICAM-1单抗阻断细胞表面ICAM-1后，EAhy926对anti-ICAM/SV/NLCs的摄取降低。采用Balb/c小鼠为模型动物，以暴露式气管滴注脂多糖建立ALI小鼠模型，尾静脉给药考察纳米粒的体内分布结果表明，anti-ICAM/SV/NLCs在模型小鼠体内的肺分布显著高于未经ICAM-1单抗修饰的SV/NLCs-3及anti-ICAM/SV/NLCs在正常小鼠体内的肺分布。
　　采用Balb/c小鼠为模型动物，以暴露式气管滴注脂多糖构建ALI小鼠模型，通过尾静脉注射给药，考察游离辛伐他汀、SV/NLCs-3和anti-ICAM/SV/NLCs对模型小鼠的体内药效。给药48h后，anti-ICAM/SV/NLCs对小鼠肺内TNF-α和IL-6炎性因子水平的抑制作用强于游离辛伐他汀和SV/NLCs-3;对于炎性细胞的肺内浸润，相比于其他药物，anti-ICAM/SV/NLCs在给药24h和48h后均表现出更强的抑制作用。HE染色观察给药24h后小鼠肺组织病理形态学，anti-ICAM/SV/NLCs较其他药物更显著的改善了模型小鼠肺内炎性细胞浸润、充血及肺泡隔增厚等病理表征。
　　研究结果表明，所构建的anti-ICAM/SV/NLCs在ALI小鼠模型体内，可通过良好的肺血管内皮细胞结合功能，改善其肺分布，提高药物的长期作用疗效。有望通过药物的肺靶向蓄积，减少给药频率，实现对ALI的安全、有效治疗。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第1章 辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备及理化性质研究

1．1 试剂与仪器

1．1．1 试剂

1．1．2 仪器

1．2 实验方法

1．2．1 纳米结构脂质载体的制备

1．2．2 纳米结构脂质载体的粒径及表面电位测定

1．2．3 纳米结构脂质载体的形态观察

1．2．4 纳米结构脂质载体的药物包封率和载药量测定

1．2．5 纳米结构脂质载体的体外药物释放行为研究

1．2．6 细胞培养

1．2．7 纳米结构脂质载体的细胞毒性评价

1．2．8 纳米结构脂质载体的细胞摄取研究

1．2．9 纳米结构脂质载体的体内分布

1．3 结果与讨论

1．3．1 空白纳米结构脂质载体的制备及理化性质评价

1．3．2 空白纳米结构脂质载体的体内分布

1．3．3 载药纳米结构脂质载体的制备及理化性质评价

1．3．4 纳米结构脂质载体的细胞毒性评价

1．3．5 纳米结构脂质载体的细胞摄取

1．4 小结

第2章 ICAM-1单克隆抗体修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备及靶向性研究

2．1 试剂与仪器

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 单氨基终端聚乙二醇单硬脂酸酯的合成

2．2．2 单氨基终端聚乙二醇单硬脂酸酯的结构确证

2．2．3 ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体(anti-ICAM／SV／NLCs)的制备

2．2．4 Anti-ICAM／SV／NLCs的粒径及表面电位测定

2．2．5 Anti-ICAM／SV／NLCs的形态观察

2．2．6 Anti-ICAM／SV／NLCs的药物包封率和载药量测定

2．2．7 Anti-ICAM／SV／NLCs的体外药物释放行为研究

2．2．8 Anti-ICAM／SV／NLCs的细胞摄取研究

2．2．9 Anti-ICAM／SV／NLCs的体内分布

2．3 结果与讨论

2．3．1 单氨基终端聚乙二醇单硬脂酸酯的合成及结构确证

2．3．2 Anti-ICAM／SV／NLCs的制备及理化性质研究

2．3．3 Anti-ICAM／SV／NLCs的细胞靶向研究

2．3．4 Anti-ICAM／SV／NLCs的动物肺靶向研究

2．4 小结

第3章 ICAM-1单克隆抗体修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体的动物药效学研究

3．1 试剂与仪器

3．1．1 试剂

3．1．2 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 实验方案

3．2．2 肺泡灌洗液的收集及炎性因子检测

3．2．3 肺泡灌洗液中炎性细胞浸润检测

3．2．4 肺组织病理形态学观察

3．3 结果与讨论

3．3．1 肺内炎性因子的改善

3．3．2 肺内炎性细胞浸润的改善

3．3．3 肺组织病理形态学的改善

3．4 小结

4 结论

参考文献

综述 肺血管内皮细胞的靶向研究进展

作者简历