ICAM‑1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体及制备与应用

摘要

本发明提供一种ICAM‑1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体，由：辛伐他汀、脂质材料、聚乙二醇单硬脂酸酯、单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯、N,N’‑二琥珀酰亚胺基碳酸酯以及ICAM‑1单克隆抗体所组成。本发明以辛伐他汀为药物，以水性溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，通过对其表面进行ICAM‑1单克隆抗体的修饰，构建特异性靶向ALI肺血管内皮细胞的ICAM‑1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体。本发明的脂质载体可靶向ALI肺血管内皮细胞、延缓辛伐他汀的释放，提高肺部病灶的药物浓集量从而提高药物治疗效率，减少辛伐他汀的肝毒性、肌毒性。从逆转ALI肺血管内皮细胞损伤的发病机制出发，有效改善ALI病症。

说明书

技术领域

本发明属于药物新型给药系统的制备，具体为对血管内皮细胞的ICAM-1受体具有特异性结合能力的ICAM-1单克隆抗体修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体及其制备方法，以及其在急性肺损伤的治疗药物制备中的应用。

背景技术

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是一种常见临床综合症，其恶化阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，具有较高的发病率及死亡率，迄今为止严重威胁着人类的生命健康。ALI的病理表征体现为大量弥漫性炎症细胞肺内浸润、肺泡和肺实质内高度水肿、肺泡透明膜形成以及后期的肺间质纤维化。在过去的十多年里，对于ALI的改善仍主要基于几种支持治疗技术，如小潮气量通气、给予PEEP、肺液体管理、抗菌疗法等。在此期间一系列的药物疗法也被应用于ALI的改善，如血管舒张剂(一氧化氮、前列环素等)的吸入治疗、肾上腺糖皮质激素、酮康唑、抗氧化剂等，但迄今尚无可观的临床治疗效果。这种令人不甚满意的药物治疗结果，一定程度上可归因于诱发ALI病因的多样异质性以及在ALI病发过程中肺泡持续的病理生理改变。因此从ALI的复杂的发病机制出发，解决ALI发病的根本原因，从而探求一个新的ALI治疗途径已得到越来越多的关注。

相对于诸如过度的炎症级联反应、氧化应激失衡、凝血纤溶异常等发病机理，肺血管损伤被广泛视为ALI病发最起初的主导原因。有研究报道由ALI引起的血管内皮改变在ALI发病中起着重要的调控作用。而中性粒细胞依赖途径被广泛视为肺内皮损伤的主要途径。由于固有免疫而积累于肺微血管系统的中性粒细胞伴随其相应的激活，通过脱颗粒及释放前炎性因子、活性氧物质、蛋白酶以及促凝血分子等导致内皮细胞损伤、肺血管通透性增强，进而诱发肺水肿发生。肺内皮功能紊乱会进一步导致肺内炎性细胞粘附及迁移增强、炎症因子及促凝抗凝调节失衡的恶性循环。此外，基于肺血管内皮细胞作为调节肺部及全身血管平衡的主要代谢器官，所以从逆转肺血管内皮细胞的损伤入手，寻找一种有效的治疗ALI的手段具有十分重要的研究价值与临床意义。

他汀类药物作为传统性的用于降低血脂的羟甲基戊二酸辅酶A还原酶抑制剂，现阶段在ALI保护的研究中已得到越来越多的应用。这基于其所具有的多向的药物特性，包括保护血管内皮细胞细胞骨架、降低超氧化物的产生、促使NO合成、上调内皮细胞炎症衰减物质integrin-β4以及与细胞间紧密连接相关的claudin-5。他汀类药物对ALI保护的临床前研究同样取得了显著进展，包括对气管内滴注LPS、机械通气、辐射等方式引发的ALI的改善，以及对其通常的初始阶段肺炎病症同样起到了积极的药物疗效。尽管迄今为止他汀类药物尚未在临床上应用于ALI的治疗，然而近年来的一些对人体ALI的改善研究取得了积极的成果。有研究显示，预先进行他汀类药物预防或治疗的患者，可显著降低ICU患者住院前4天脓毒症及ALI/ARDS的发生率，充分证明了他汀类药物用于预防或治疗急性肺损伤的潜在临床价值，从而使他汀类药物有可能成为通过逆转肺血管内皮细胞损伤过程而治疗ALI的新一代药物。然而他汀类在真正成为ALI的治疗药物之前尚需克服下列问题：①疗效不确定，2010年在爱尔兰进行的一项随机对照研究显示：80mg辛伐他汀用于治疗ALI机械通气患者，尽管第14天治疗组患者具有更好的氧合指数和通气参数，但与空白组相比无显著性差异；②不良反应多，主要表现为肌肉溶解以及由于氧化应激及线粒体功能紊乱导致的肝毒性、中枢神经系统毒性等。基于脂溶性他汀药物可以通过被动扩散的方式被细胞摄取从而更易于作用于细胞发挥药效，故本发明选用他汀类药物中亲脂性最强的辛伐他汀为研究药物。然而，同样由于较高的组织渗透性，相对于水溶性他汀而言，脂溶性他汀具有更高的药物副作用发生率。为克服他汀类药物用于治疗ALI的上述不足，本专利将他汀类药物包裹于纳米结构脂质载体中，通过纳米结构脂质载体将药物靶向输送到ALI血管内皮细胞，增强病灶部位的药物积累，显著提高药物治疗效率。在从ALI的发病机制出发逆转血管内皮细胞损伤的同时，减少他汀类药物的不良反应。

研究报道ALI可诱导血管内皮细胞产生各类生物标记物，包括von Willebrand因子、Ang-2以及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)。ICAM-1作为表达于内皮细胞表面的跨膜糖蛋白，其表达水平与炎症强度密切相关。国外多位学者将其应用于纳米载体的靶向设计中，他们的研究成果证实：通过对纳米载体表面进行ICAM-1单克隆抗体的修饰，利用ICAM-1单抗与血管内皮细胞表面ICAM-1受体特异性结合的原理，可实现纳米载体对血管内皮细胞的靶向输送。本发明选用纳米给药系统中的纳米结构脂质载体作为药物递送系统。纳米结构脂质载体作为一种新型的给药系统，具有下列给药特性：①良好的生物相容性；②药物缓、控释释放；③较低的生物毒性；④易于制备等等。基于纳米结构脂质载体的上述特性，通过对他汀类药物的高效包载，并对纳米载体表面进行ICAM-1单抗修饰，使他汀类药物靶向输送到ALI血管内皮细胞的设想成为现实。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体。该ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体主要由：辛伐他汀、脂质材料、聚乙二醇单硬脂酸酯(MW 2000)、单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯、N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯以及ICAM-1单克隆抗体所组成。处方成分质量百分比为4.98％-14.95％辛伐他汀、83.72％-93.68％的脂质材料、0％-9.97％的聚乙二醇单硬脂酸酯(MW 2000)、1.00％的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯、0.22％N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和0.11％的ICAM-1单克隆抗体。所述的脂质材料选用单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸、中链脂肪酸甘油酯中的一种或两种。

本发明的第二个目的是提供ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备方法，具体通过以下方案实现：

1.合成单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯

称取119.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,24.0mg N-羟基琥珀酰亚胺,35.5mg硬脂酸溶于3ml无水二甲基亚砜,400rpm 60℃条件下反应30min，将反应液缓慢滴加至2ml无水二甲基亚砜溶解的250mg双氨基终端聚乙二醇溶液中，室温下400rpm搅拌反应24h。反应结束后，反应液转移至透析袋中(MWCO：7kDa)，纯净水透析48h，除去水溶性副产物，冷冻干燥即得单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯。

2.ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5-15mg的辛伐他汀、84-94mg的脂质材料、0-10mg的聚乙二醇硬脂酸酯(MW 2000)以及1mg合成的氨基终端的聚乙二醇单硬脂酸酯，共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体。

本发明的再一个目的是提供所述的ICAM-1单抗修饰辛伐他汀纳米结构脂质载体在制备靶向ALI肺血管内皮细胞药物中的应用。

本发明以辛伐他汀为药物，以脂质材料和聚乙二醇单硬脂酸酯为主要材料，以水性溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，通过对其表面进行ICAM-1单克隆抗体的修饰，构建特异性靶向ALI肺血管内皮细胞的ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体，并评价其对ALI的改善作用。从逆转ALI肺血管内皮细胞损伤的发病机制出发，探寻一种安全、高效的ALI他汀靶向治疗新途径。

本发明的有益之处，是所提供的ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体可靶向ALI肺血管内皮细胞、延缓辛伐他汀的释放，提高肺部病灶的药物浓集量从而提高药物治疗效率，减少辛伐他汀的肝毒性、肌毒性。从逆转ALI肺血管内皮细胞损伤的发病机制出发，有效改善ALI病症。

附图说明

图1是辛伐他汀纳米结构脂质载体透射电子显微镜照片。

图2是辛伐他汀纳米结构脂质载体释药曲线。

图3是辛伐他汀纳米结构脂质载体体内分布活体成像。

图4是辛伐他汀纳米结构脂质载体对急性肺损伤的保护作用。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

1.合成单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯

称取119.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,24.0mg N-羟基琥珀酰亚胺,35.5mg硬脂酸溶于3ml无水二甲基亚砜,400rpm 60℃条件下反应30min，将反应液缓慢滴加至2ml无水二甲基亚砜溶解的250mg双氨基终端聚乙二醇溶液中，室温下400rpm搅拌反应24h。反应结束后，反应液转移至透析袋中(MWCO：7kDa)，纯净水透析48h，除去水溶性副产物，冷冻干燥即得单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯。

2.ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、94mg单硬脂酸甘油酯,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为204.5±4.56nm，217.4±24.25nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为81.32％和4.10％。

实施例2 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取10mg辛伐他汀、89mg单硬脂酸甘油酯,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为245.6±12.4nm，257.2±20.7nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为85.70％和8.69％。

实施例3 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取15mg辛伐他汀、84mg单硬脂酸甘油酯,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为274.3±7.3nm，278.9±13.6nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为75.42％和11.75％。

实施例4 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、94mg硬脂酸,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为213.7±10.5nm，223.9±7.7nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为79.53％和4.02％。

实施例5 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取10mg辛伐他汀、89mg硬脂酸,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为252.7±13.6nm，277.89±11.5nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为83.11％和8.45％。

实施例6 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取15mg辛伐他汀、84mg硬脂酸,1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为280.2±9.3nm，283.5±3.5nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为74.25％和11.58％。

实施例7 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、84mg单硬脂酸甘油酯,10mg油酸，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为284.5±5.7nm，290.4±14.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为83.53％和4.21％。

实施例8 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、74mg单硬脂酸甘油酯,20mg油酸，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为312.5±14.3nm，316.7±17.1nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为87.45％和4.40％。

实施例9 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、64mg单硬脂酸甘油酯,30mg油酸，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为342.6±24.6nm，347.8±19.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为85.32％和4.30％。

实施例10 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、84mg单硬脂酸甘油酯,10mg中链脂肪酸甘油酯，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入ICAM-150μg单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为302.5±12.5nm，311.5±12.7nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为87.93％和4.42％。

实施例11 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、74mg单硬脂酸甘油酯,20mg中链脂肪酸甘油酯，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为322.1±17.7nm，330.6±20.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为92.19％和4.63％。

实施例12 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、64mg单硬脂酸甘油酯,30mg中链脂肪酸甘油酯，1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为345.1±12.7nm，355.6±23.7nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为91.18％和4.58％。、

实施例13 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、74mg单硬脂酸甘油酯,10mg油酸，10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为295.5±13.7nm，310.4±14.8nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为82.25％和4.15％。

实施例14 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、64mg单硬脂酸甘油酯,20mg油酸，10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为320.7±20.1nm，325.0±19.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为86.55％和4.36％。

实施例15 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、54mg单硬脂酸甘油酯,30mg油酸，10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为340.2±23.3nm，345.9±15.1nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为85.22％和4.29％。

实施例16 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、74mg单硬脂酸甘油酯,10mg中链脂肪酸甘油酯、10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为317.5±15.8nm，323.9±14.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为86.72％和4.36％。

实施例17 ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、64mg单硬脂酸甘油酯,20mg中链脂肪酸甘油酯、10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为337.8±25.8nm，354.7±18.2nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为91.04％和4.43％。

实施例18

1.ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的制备

溶剂扩散法制备辛伐他汀纳米结构脂质载体，具体方法：精密称取5mg辛伐他汀、54mg单硬脂酸甘油酯,30mg中链脂肪酸甘油酯、10mg聚乙二醇单硬脂酸酯、1mg合成的单氨基终端的聚乙二醇硬脂酸酯,共100mg，加入1ml乙醇溶解作为有机相，水浴60℃加热，使材料完全融化。注射器吸取0.45ml融化的材料，乙醇稀释至0.5ml，以去离子水为分散介质，在400rpm搅拌速度下将有机相依次快速注入60℃水浴加热的4.5ml的去离子水中，注射完毕搅拌30s后取出，自然冷却至室温，制得脂质浓度9mg/ml的辛伐他汀纳米结构脂质载体。加入0.1mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，涡旋1min分散均匀后室温下孵育反应3h，加入50μg ICAM-1单克隆抗体，涡旋1min分散均匀后室温下继续孵育反应3h。本反应通过N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯连接药物载体上聚乙二醇的氨基与ICAM-1单克隆抗体上的氨基，将抗体成功嫁接到药物载体上，冷冻干燥即得ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体。

采用动态光散射法测定所制备纳米粒的粒径大小。将样品以去离子水稀释至0.1mg/ml，以马尔文Zetasizer Nano-S90纳米粒度分析仪测定ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的粒径分别为342.5±23.6nm，358.1±22.7nm。

采用调酸离心法配合高效液相法测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率和载药量。向制备完毕后静置至室温的未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米粒分散液中加入适量0.1M的盐酸，至体系的PH降至1.2以促使纳米粒絮凝，20000rpm离心30min，HPLC测定上清液中药物浓度，按以下公式计算辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量。

包封率＝(脂质纳米粒中的药物质量/总投药量)×100％

载药量＝(脂质纳米粒中的药物质量/载药纳米粒总质量)×100％

经测定，未经ICAM-1单抗修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体的包封率及载药量分别为87.02％和4.38％。

2.辛伐他汀纳米结构脂质载体的形态观察

取实例十七中冷冻干燥前的脂质纳米粒稀释至100μg/ml，将稀释后纳米粒分散液滴至铜网上，自然干燥，以1％的醋酸双氧铀溶液负染1min，JEM-1200EX型透射电子显微镜观察其形态。经ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体形态如图1所示，呈类球形；单抗修饰前后的纳米粒粒径大小相近。

3.辛伐他汀纳米结构脂质载体的体外药物释放考察

取实例十七中冷冻干燥前的辛伐他汀纳米结构脂质载体分散液稀释9倍至分散液中药物浓度为50μg/ml。精密称定辛伐他汀10mg,一定乙醇溶解后以PH7.4的PBS溶液稀释至50μg/ml。采用透析袋法，分别取辛伐他汀标准品溶液以及稀释后的经抗体修饰或未修饰的辛伐他汀纳米结构脂质载体溶液1ml于透析袋中，置于含有15ml PH7.4的PBS释放管内，37℃，60rpm恒温震荡。在设定时间点取样1ml,并补足1ml新鲜PBS溶液。高效液相法测定释放介质中辛伐他汀浓度，计算辛伐他汀的累积释放量。经测定辛伐他汀纳米结构脂质载体的释放行为如图2所示，与单纯游离药物相比，载药纳米粒对药物具有缓释作用；ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体体外释放行为相似。

4.急性肺损伤动物模型的构建以及ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体的肺部靶向性研究

以Balb/c小鼠构建动物模型。将小鼠以5％水合氯醛进行麻醉(450mg/kg)，暴露式气管滴注法，缓慢滴注溶于50μl生理盐水的脂多糖(2μg/g,bodyweight)，6h后给药进行药效评价。

为评价实例十七中ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体的肺部靶向性，以Dir作为荧光探针将其包载入脂质纳米粒中。将Balb/c小鼠进行以下分组:A组:正常鼠+ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体组；B组:滴注生理盐水鼠+ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体组；C组:模型鼠+ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体组；D组:模型鼠+辛伐他汀纳米结构脂质载体组。造模6h后，尾静脉静注给药。分别于给药后5h、24h处死小鼠，活体成像仪观察并拍照。经观察ICAM-1单抗修饰前后的辛伐他汀纳米结构脂质载体的体内分布特性如图3所示，ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体在模型小鼠肺部分布明显强于正常小鼠以及曝露气管滴注生理盐水的小鼠，说明经LPS刺激后，模型组小鼠肺血管内皮细胞高量表达了ICAM-1粘附分子，且ICAM-1单抗成功嫁接到纳米载体上，通过抗体受体特异性结合，ICAM-1单抗纳米结构脂质载体得以大量分布于模型小鼠的肺中；同时ICAM-1单抗修饰的纳米结构脂质载体较无ICAM-1单抗修饰的纳米结构脂质载体在模型鼠的肺内分布更多，体现出ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体的肺部靶向特性。

5.HE染色评价ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体对急性肺损伤的保护作用为评价实例十七中ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体对急性肺损伤的保护作用，将Balb/c小鼠进行以下分组，A组：对照组；B组：模型组；C组：模型+游离辛伐他汀给药组；D组：模型+辛伐他汀纳米结构脂质载体给药组；E组：模型+ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体给药组。小鼠造模6h后，A组、B组尾静脉注射0.2ml生理盐水；C组尾静脉注射200μg/ml的游离辛伐他汀药物溶液；D组尾静脉注射辛伐他汀纳米结构脂质载体；E组尾静脉注射ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体(各个给药组辛伐他汀的给药剂量均为2mg/kg)。给药24h后处死小鼠，取出肺部器官以4％中性甲醛固定48h，HE染色，光镜下观察各组肺部病理切片特征，评价药物制剂对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的改善情况。结果如图4所示，游离辛伐他汀药物溶液组、辛伐他汀纳米结构脂质载体组以及ICAM-1单抗辛伐他汀纳米结构脂质载体组小鼠的肺部组织切片病理情况较模型组均得到一定程度的改善。治疗组小鼠的病理切片照片相对于模型组而言：肺泡内浸润的炎性细胞明显减少，肺泡结构可见，其中ICAM-1辛伐他汀纳米结构脂质载体实验组改善情况最为显著。分析结果表明，ICAM-1辛伐他汀纳米结构脂质载体对本课题中模型动物急性肺损伤病症可以起到保护作用。