墨西哥黄唇鱼胶原肽促进小鼠皮肤伤口愈合作用的研究

摘要

以人工增殖放流的墨西哥黄唇鱼（加利福尼亚湾石首鱼）肉为原料，经复合酶解得到墨西哥黄唇鱼胶原肽(Totoaba macdonaldi-meat collagen peptides，TMCP)，围绕其促进皮肤伤口愈合的性能及可能的生物学机制，分别从体外细胞水平和整体动物水平进行研究。主要研究内容及结果汇总如下:
　　(1)TMCP的酶法制备:以墨西哥黄唇鱼肉为原料，采用复合酶法(Alcalase碱性蛋白酶、Flavourzyme复合风味蛋白酶)，以水解度(DH)为响应值，在单因素试验的基础上进行四因素三水平的响应面分析，得到的优化工艺参数为:酶解温度55℃、水解时间4h、体系pH7.0、酶总用量1.0％，该条件下实际测得DH为63.90％。采用Waters凝胶色谱法测得该TMCP平均分子量(Mw)为837Da，由5～8个氨基酸组成;采用日立全自动氨基酸分析仪从中检测出22种氨基酸，其中富含羟脯氨酸(1.24％)、γ-氨基丁酸(1.03％)、牛磺酸(0.74％)和鸟氨酸(0.37％)，具有高的营养和医用保健价值。
　　(2)体外细胞水平试验:探究TMCP对成纤维细胞株NIH/3T3增殖、迁移及胶原合成的影响。采用CCK8法测定，显示TMCP能促进NIH/3T3细胞的增殖，在所试浓度范围(25～100μg/mL)内，TMCP对细胞增殖率的促进作用和对羟脯氨酸含量的提升效果都极显著地高于对照组(p＜0.01)，与阳性对照药物(bFGF)相当;当试样浓度为50μg/mL时，表现出最佳效果。选择该TMCP浓度进行细胞划痕实验，经36h全程监测发现，试验组自12h起，与对照组相比，极显著地提高了细胞的迁移率(p＜0.01)，与bFGF效果相当。
　　(3)整体动物试验:采用小鼠皮肤皮肤创伤模型，对40只健康雄性ICR小鼠进行切除型伤口造模处理，造模后次日起分别用低、中、高三个剂量的TMCP(0.66、1.33、2.0g/kg·bw)和等体积的去离子水（空白对照）连续灌胃14d，每隔2d测定伤口愈合率。分别于造模后的第7d和第14d分批处死动物，取伤口边缘的皮肤组织，经HE染色和Masson染色进行组织学观察，并测定羟脯氨酸含量和进行免疫组化分析。结果表明，在第7d、14d时，TMCP中、高剂量组在伤口愈合率、胶原含量、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)表达量等指标上均极显著优于对照组(p＜0.01);第14d时，TMCP低剂量组也在上述指标上与对照组呈现极显著差异(p＜0.01)。
　　综上所述，体内外试验表明，采用复合酶解法从墨西哥黄唇鱼肉制备得到的寡肽(TMCP)可有效促进成纤维细胞的增殖，促进实验小鼠皮肤伤口的胶原表达和组织重塑，作为一种天然来源的口服功能性食材，对于难愈型伤口的修复可能具有特殊意义。同时，该研究成果也为取鳔后墨西哥黄唇鱼体的综合利用和高值转化提供了思路和依据。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语表

1．1．1 石首鱼科

1．1．2 中国黄唇鱼

1．1．3 墨西哥黄唇鱼

1．2 胶原肽概述

1．2．1 胶原

1．2．2 胶原肽的生物学效应

1．3 皮肤伤口愈合过程

1．3．1 炎症期

1．3．2 增生期

1．3．3 重塑期

1．4 皮肤创伤模型

1．4．1 体外皮肤创伤模型

1．4．2 整体动物皮肤创伤模型

1．3．3 伤口愈合临床药物的研究进展

1．5 立题依据及主要研究内容

1．5．1 立题背景及意义

1．5．2 主要研究内容

第二节 墨西哥黄唇鱼胶原肽(TMCP)的酶法制备

2．1 材料试剂与仪器

2．1．1 试验材料与试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 墨西哥黄唇鱼肉基本营养成分的测定

2．2．2 TMCP的制备流程

2．2．3 酶解墨西哥黄唇鱼肉的影响因素

2．2．4 TMCP酶法制备工艺优化试验

2．2．5 TMCP的分子量分布测定

2．2．6 TMCP的氨基酸组成测定

2．3 数据处理

2．4 结果与分析

2．4．1 墨西哥黄唇鱼肉基本组成成分的分析

2．4．2 酶法制备TMCP的影响因素分析

2．4．3 TMCP酶法制备工艺优化结果

2．4．4 TMCP的分子量分布

2．4．5 TMCP的氨基酸组成

2．5 讨论

第三节 TMCP对成纤维细胞增殖、迁移及胶原蛋白合成的作用

3．1 材料试剂与仪器

3．1．1 试验材料与试剂

3．1．2 主要仪器设备

3．2 试验方法

3．2．1 试剂配制

3．2．2 NIH／3T3细胞实验操作

3．2．3 NIH／3T3细胞生长曲线的绘制

3．2．4 TMCP对NIH／3T3细胞增殖率的影响

3．2．5 TMCP对NIH／3T3细胞羟脯氨酸含量的影响

3．2．6 TMCP对NIH／3T3细胞迁移的影响

3．3 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 NIH／3T3细胞的生长曲线

3．4．2 TMCP对NIH／3T3细胞增殖率的影响

3．4．3 TMCP对NIH／3T3细胞羟脯氨酸含量的影响

3．4．4 TMCP对NIH／3T3细胞迁移的影响

3．5 讨论

第四节 TMCP对小鼠皮肤伤口愈合的作用

4．1 材料试剂与仪器

4．1．1 试验材料与试剂

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 实验动物及饲养条件

4．2 试验方法

4．2．1 小鼠皮肤创伤模型的构建

4．2．2 动物分组与实验

4．2．3 伤口愈合率测定

4．2．4 伤口组织病理学分析(HE染色)

4．2．5 胶原含量分析(Masson染色)

4．2．6 伤口组织的羟脯氨酸含量测定

4．2．7 免疫组织化学染色法分析

4．3 数据处理

4．4 结果与分析

4．4．1 TMCP对小鼠伤口愈合率的影响

4．4．2 TMCP对小鼠皮肤伤口组织病理变化的影响

4．4．3 TMCP对小鼠伤口组织中胶原含量的影响

4．4．4 TMCP对小鼠伤口组织中羟脯氨酸含量的影响

4．4．5 免疫组织化学染色分析结果

4．5 讨论

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简介