代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

摘要

丁二酸，又名琥珀酸，化学式为C4H6O4，是一种优秀的C4平台化合物，被广泛应用于制备各药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物。传统化学法合成以不可再生资源石油为原料，成本高，环境污染严重。微生物发酵法生产丁二酸，以可再生资源糖为原料，具有成本低，环境污染小的优点。因此进行丁二酸的生物法研究具有极大的现实意义。
　　由于丁二酸有氧培养阶段为三羧酸循环代谢中间产物积累较少，因此一般采用两阶段培养模式生产丁二酸，有氧阶段提高菌体浓度，厌氧发酵产酸。厌氧阶段产生副产物如乙酸、乳酸、甲酸等降低原料利用率。为提高丁二酸得率，降低副产物产量，同时增强丁二酸合成途径成为构建高产菌株主要手段。本文以大肠杆菌AFP111为出发菌株，进行乙酸合成基因敲除，同时过表达关键基因提高丁二酸得率。首先敲除乙酸激酶和磷酸转乙酰酶(其编码基因为ackA-pta)获得SX01菌株乙酸产量下降了44.86％，丁二酸得率增加了4.55％。在SX01菌株基础上，敲除苏氨酸脱酸酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶(其编码基因分别为tdcD和tdcE)获得菌株SX02，乙酸产量减少了15.53％，丁二酸得率提高了5.07％，生产效率下降13.16％。随后为提高糖转运速率，对编码葡萄糖激酶的基因glk启动子改造获得菌株SX03，较SX02的Glk酶活性提升3.66倍，葡萄糖利用率由0.69g/(L·h)增至1.04g/(L·h)，丁二酸得率提高8.28％，生产效率提高62.12％，乙酸产量下降31.62％。在SX03菌株的基础上进行编码半乳糖转运体galp进行改造，利用运动单胞菌株密码子优化后的葡萄糖促进蛋白，其编码及因为glf替换galp基因，获得的菌株SX04并无明显效果，反而使Glk酶活性降低了3.97倍，糖利用效率下降，丁二酸得率下降5.73％，此时该替换并无显著效果，可能由于选择启动子启动效率过低。随后以SX03为出发菌株进行磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因pck启动子改造后获得菌株SX05，Pck酶活性提高10.58倍，但其丁二酸得率下降4.46％，该菌株Glk酶活性下降45.13％，可能由于Pck催化产生ATP，Glk酶活性受ATP含量调控，ATP含量过高，使得Glk酶活性被抑制，糖转运效率下降，进而导致丁二酸得率下降。
　　选择高产丁二酸菌株SX03进一步放大，首先以碱式碳酸镁为pH调节剂5L罐发酵，厌氧阶段SX03相比AFP111乙酸产量减少75.76％，生产效率提高72.52％，丁二酸得率1.62mol/mol，提高了19.12％。其次，为降低生产成本以NaOH和Na2CO3替换碱式碳酸镁，优化厌氧发酵阶段pH、搅拌转速、初始葡萄糖浓度，优化结果表明当厌氧阶段pH为6.8、初始葡萄糖含量为100g/L、搅拌转速为250r/min，产生丁二酸72.33g/L，得率为1.66mol/mol，乙酸产量为2.24g/L。最后，将该菌株进行100L发酵罐初步放大验证，结果表明厌氧67h，丁二酸产量为51.95g/L，体积为82L，乙酸产量为1.91g/L，丁二酸得率为1.30mol/mol，生产效率为0.79g/(L·h)。
　　通过代谢工程改造的大肠杆菌，其乙酸副产物含量显著下降、丁二酸得率提高，并在5L和100L发酵罐上实现工艺放大，展现出较大工业化利用潜力。

目录

声明

摘要

1．1 丁二酸的概况

1．1．1 丁二酸的理化性质

1．1．2 丁二酸的合成

1．2 改造菌株生成丁二酸的研究策略

1．2．1 原料

1．2．2 改变渗透压

1．2．3 基因改造

1．3 本文研究相关的改造策略

1．3．1 减少乙酸的生成提高丁二酸含量

1．3．2 改造葡萄糖转运效率

1．3．3 增强PEP生成OAA的代谢节点

1．3．4 基因改造示意图

1．4 立项依据及内容

1．5 技术路线

第2章 代谢工程改造大肠杆菌构造高产丁二酸菌株

2．1 材料

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 引物

2．1．3 培养基

2．1．4 试剂及仪器设备

2．2 方法

2．2．2 菌株培养条件

2．2．3 菌株浓度测定

2．2．4 葡萄糖、乙酸、丁二酸的含量检测

2．2．5 酶活性测定

2．2．6 菌株的基因遗传改造

2．2．7 用于基因改造的目的片段的制备

2．3 实验结果

2．3．1 ackA-pta敲除

2．3．2 tdcDE敲除

2．3．3 glk启动子改造

2．3．4 galp改造

2．3．5 pck启动子改造

2．3．6 ackA-pta、tdcDE敲除菌株的发酵结果

2．3．7 glk和galp、pdc改造发酵结果

2．4 实验小结

第3章 高产丁二酸代谢工程菌株发酵罐放大工艺

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．3．1 碱式碳酸镁为pH调节剂SX03菌株的5 L发酵罐发酵

3．3．2 Na2CO3为调节剂I的SX03菌株pH优化

3．3．3 SX03菌株厌氧阶段发酵搅拌转速优化

3．3．4 SX03菌株厌氧阶段发酵初始糖浓度优化

3．3．5 SX03菌株分批补料发酵

3．3．6 SX03菌株的100 L发酵罐发酵

3．4 实验小结

4．1 结论

4．2 创新点

4．3 展望

参考文献

致谢

作者简介

附录