Nrf2-ARE信号通路介导的苯乙醇苷神经保护作用及机理研究

摘要

神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)多发于老年群体，具有病情发展缓慢、发病率高、治愈率低等特点，对患者的健康生活造成较大影响，氧化应激是该类疾病的重要发病机制。核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2 related factor2，Nrf2)是内源性抗氧化系统中的关键元件，氧化应激条件下调控机体抗氧化系统，进而发挥对机体的保护作用。Nrf2激活剂可以增强机体抗氧化应激的能力，在多种神经退行性疾病中表现出良好的保护作用。
　　本研究以已报道的178种天然抗氧化剂为研究对象，通过分子对接筛选出具有激活Nrf2活性的苯乙醇苷（Phenylpropanoid glycosides，PhGs），并利用氧化损伤细胞和动物模型，从基因和蛋白水平深入研究其神经保护作用及作用机制，为苯乙醇苷特别是毛蕊花糖苷应用于预防帕金森疾病(Parkinson's disease，PD)的发生奠定了理论基础。本文主要研究内容及结果如下:
　　1.建立178种天然抗氧化剂数据库，利用分子对接筛选Nrf2的潜在激活剂。结果表明，不同类型化合物与Keap1的亲和力差异明显，亲和力排名较好的三类化合物为:苯乙醇苷类(7.31)＞维生素E类(6.25)＞黄酮类(5.03)。根据化合物与Keap1的亲和力将上述化合物分为Keap1高亲和力组(Total_ Score＞6)、Keap1中亲和力组(3＜Total_Score＜6)和Keap1低亲和力组（Total_Score＜3），高亲和力组化合物可以显著提高氧化应激损伤细胞模型细胞核中Nrf2的含量。24个高亲和力组化合物可以作为潜在的Nrf2激活剂，其中苯乙醇苷类化合物是较佳候选化合物。
　　2.以与Keap1亲和力较高的红景天苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和松果菊苷四种苯乙醇苷类化合物为研究对象，研究其对氧化应激损伤细胞的保护作用。结果表明，苯乙醇苷可以显著提高PC12细胞增殖率(p＜0.01)、细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px活性(p＜0.01)，同时显著降低PC12细胞内ROS水平(p＜0.01)、细胞内MDA含量(p＜0.01)和细胞凋亡率(p＜0.01)，显示出较强的抗氧化应激作用，其中毛蕊花糖苷效果较好。
　　3.以红景天苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和松果菊苷为研究对象，结合免疫荧光、siRNA干扰、Western blot、RT-PCR等多种分子生物学手段，从蛋白质和mRNA水平阐明这四种化合物的抗氧化应激作用机制。结果表明，苯乙醇苷预处理，可以促进Nrf2向核内转移，同时，显著提高Nrf2下游Ⅱ相解毒酶的表达(p＜0.01)。NRF2 knockdown和HO-1蛋白抑制剂验证实验表明，Nrf2的激活和HO-1的高表达是苯乙醇苷增强细胞抗氧化能力的主要原因。苯乙醇苷通过竞争性结合Keap1-Nrf2结合界面上的关键氨基酸残基，干扰Keap1-Nrf2结合，从而激活Nrf2-ARE信号通路。
　　4.基于6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的斑马鱼PD模型，探讨毛蕊花糖苷对PD斑马鱼的保护作用。结果表明，毛蕊花糖苷能够减少大脑黑质多巴胺能神经元凋亡，中、高浓度显著改善斑马鱼运动行为，使其运动轨迹趋于正常，运动频率升高，其中高浓度组斑马鱼运动速度升幅达19.2％。毛蕊花糖苷显著降低MDA含量(p＜0.01)，显著提高抗氧化酶活性(p＜0.01)，综合三个抗氧化酶活性变化，三个浓度处理组的作用效果如下:中浓度组＞高浓度组≈低浓度组。
　　5.依据PD的发病机制和病理特点，从Nrf2信号通路、PD相关基因及血脑屏障三方面展开研究，探讨毛蕊花糖苷通过增强机体抗氧化应激能力预防PD发生的作用机制。结果表明，毛蕊花糖苷可以透过血脑屏障，显著提高Nrf2-ARE信号通路上主要作用元件的转录水平(p＜0.01)，显著提高PD相关基因的转录水平(p＜0.01)。此外，随着PD斑马鱼运动障碍、多巴胺能神经元凋亡等症状的减轻，其血脑屏障功能障碍逐步改善。
　　综上所述，苯乙醇苷类化合物与Keap1亲和力高，是Nrf2的潜在激活剂。在氧化应激损伤细胞模型中，苯乙醇苷类化合物通过竞争性结合Keap1-Nrf2结合界面上关键氨基酸残基激活Nrf2-ARE信号通路，进而提高细胞内抗氧化酶活性、降低细胞内ROS和MDA含量，最终减少由氧化应激损伤引起的细胞凋亡，其中毛蕊花糖苷抗氧化应激效果较佳。在氧化应激损伤动物模型中，毛蕊花糖苷可以透过血脑屏障、提高Nrf2-ARE信号通路及抗氧化应激基因转录，对氧化应激导致的PD起到改善作用，是预防PD发生的潜在药物。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 神经退行性疾病研究进展

1．1．1 神经退行性疾病概述

1．1．2 神经退行性疾病发病机制

1．1．3 天然抗氧化剂与神经退行性疾病

1．2 Nrf2-ARE信号通路在神经退行性疾病中的作用研究进展

1．2．1 Nrf2-ARE信号通路概述

1．2．2 Nrf2-ARE信号通路与神经退行性疾病

1．2．3 天然抗氧化剂与Nrf2激活剂

1．3 苯乙醇苷类化合物研究进展

1．3．1 苯乙醇苷类化合物概述

1．3．2 苯乙醇苷类化合物生物活性

1．3．3 苯乙醇苷类化合物与神经退行性疾病

1．4 天然产物抗氧化活性的常见评价方法

1．4．1 化学分析法

1．4．2 细胞模型

1．4．3 动物模型

1．5 分子对接与药物筛选

1．6 研究背景及主要内容

1．6．1 研究背景和意义

1．6．2 研究主要内容

1．6．3 技术路线图

第二章 基于分子对接的天然抗氧化剂对Nrf2激活作用研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 生物学软件

2．2．2 细胞品系

2．2．3 试剂与耗材

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 天然抗氧化剂的整理与配体分子的准备

2．3．2 天然抗氧化剂与Keap1蛋白分子对接

2．3．4 细胞培养

2．4．5 细胞活力检测

2．3．6 细胞质蛋白与细胞核蛋白分离提取

2．3．7 蛋白质定量检测

2．3．8 Western Blot

2．3．9 数据分析

2．4 结果与分析

2．4．1 天然抗氧化剂与Keap1分子对接结果分析

2．4．2 天然抗氧化剂与Keap1分子对接影响因素分析

2．4．3 天然抗氧化剂与Keap1亲和力的3D-QSAR分析

2．4．4 天然抗氧化剂的细胞毒性分析

2．4．5 天然抗氧化剂对Nrf2的激活能力分析

2．5 本章小结

第三章 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞的保护作用研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 细胞品系

3．2．2 试剂与耗材

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 细胞活力测定

3．3．3 蛋白质定量检测

3．3．4 细胞内SOD、GSH-Px、CAT酶活力检测

3．3．5 细胞内MDA含量检测

3．3．6 细胞内ROS水平检测

3．3．7 细胞凋亡率检测

3．3．8 DAPI染色

3．3．9 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 苯乙醇苷的细胞毒性分析

3．4．2 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞增殖率的影响

3．4．3 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞抗氧化酶活性的影响

3．4．4 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞ROS水平的影响

3．4．5 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞MDA含量的影响

3．4．6 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞凋亡率的影响

3．5 本章小结

第四章 苯乙醇苷对氧化应激损伤细胞的保护作用机制研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 细胞品系

4．2．2 试剂与耗材

4．2．3 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养

4．3．2 免疫荧光检测

4．3．3 蛋白质提取方法

4．3．4 蛋白质定量检测

4．3．6 总RNA提取

4．3．7 反转录

4．3．8 RT-PCR

4．3．9 抑制剂处理

4．3．10 siRNA转染

4．3．11 数据分析

4．4 结果与分析

4．4．1 苯乙醇苷对细胞内Nrf2分布的影响

4．4．2 苯乙醇苷对细胞保护作用中Nrf2效果确证

4．4．3 苯乙醇苷对Nrf2下游Ⅱ相解毒酶的影响

4．4．4 苯乙醇苷对细胞保护作用中Ⅱ相解毒酶HO-1效果确证

4．4．5 苯乙醇苷对Nrf2内源性蛋白抑制剂Keap1的影响

4．4．6 苯乙醇苷对Nrf2-ARE信号通路激活机制分析

4．5 本章小结

第五章 毛蕊花糖苷对6-OHDA诱导的PD斑马鱼的保护作用研究

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 试剂与耗材

5．2．3 主要仪器

5．3 实验方法

5．3．1 斑马鱼的饲养

5．3．2 配鱼与鱼卵收集

5．3．3 毛蕊花糖苷最大耐受剂量筛选

5．3．4 斑马鱼行为学检测

5．3．5 斑马鱼体内SOD、GSH-Px、CAT酶活力检测

5．3．6 斑马鱼体内MDA含量检测

5．3．7 酪氨酸羟化酶活性检测

5．3．8 数据分析

5．4 结果与分析

5．4．1 斑马鱼对毛蕊花糖苷的耐受剂量分析

5．4．2 毛蕊花糖苷对PD斑马鱼行为学的影响

5．4．3 毛蕊花糖苷对PD斑马鱼MDA含量的影响

5．4．4 毛蕊花糖苷对PD斑马鱼抗氧化酶活性的影响

5．4．5 毛蕊花糖苷对PD斑马鱼黑质多巴胺能神经元的影响

5．5 本章小结

第六章 毛蕊花糖苷对6-OHDA诱导的PD斑马鱼的保护作用机制研究

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 实验动物

6．2．2 试剂与耗材

6．2．3 主要仪器

6．3 实验方法

6．3．1 斑马鱼的饲养

6．3．3 总RNA提取

6．3．4 反转录

6．3．5 RT-PCR

6．3．6 斑马鱼幼鱼毛蕊花糖苷暴露处理

6．3．7 斑马鱼成鱼毛蕊花糖苷腹腔注射处理

6．3．8 UHPLC-PDA分析

6．3．9 伊文思蓝染色

6．3．10 数据分析

6．4 结果与分析

6．4．1 毛蕊花糖苷对NRF2基因转录的影响

6．4．2 毛蕊花糖苷对Nrf2下游Ⅱ相解毒酶基因转录的影响

6．4．3 毛蕊花糖苷对PD相关基因转录的影响

6．4．4 毛蕊花糖苷对血脑屏障透过性的研究

6．4．6 毛蕊花糖苷对已受损血脑屏障的影响

6．5 本章小结

7．1 全文总结

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录

个人简介

攻读博士期间主要科研成果

攻读博士期间获奖情况