大鼠脑出血后Nrf2-ARE信号通路对灶周神经保护作用及内源性神经干细胞激活的机制研究

摘要

目的:第一部分:近期研究发现Nrf2(核转录因子-2)/ARE（抗氧化反应元件）信号通路在体内具有抗氧化应激作用、抗炎性反应和神经细胞保护作用。本部分研究采用莱菔硫烷激活Nrf2-ARE信号通路，维甲酸抑制Nrf2-ARE信号通路，观察Nrf2-ARE信号通路对脑出血灶周神经保护作用及其相关机制探索;第二部分:有文献报道脑损伤后脑内各部位有内源性神经干细胞激活和增殖，且向灶周损伤区域迁徙，但相关机制不明确。本部分研究脑出血后内源性神经干细胞激活增殖及相关TGF-β机制的探讨。
　　方法:第一部份:采用SD大鼠基底节自体动脉血注射法建立脑出血模型，分四组:单纯脑出血组、莱菔硫烷(Nrf2激活剂，SFN)处理脑出血组和维甲酸(RA，Nrf2抑制剂)处理脑出血和正常对照组，观察不同时间点大鼠神经功能评分，取脑组织行免疫组化检测，免疫荧光检查及Western blot检测Nrf2、HO-1、NF-κB表达。对所得数据进行统计分析，观察脑出血灶周神经保护的作用。第二部分:采用SD大鼠基底节自体动脉血注射法建立脑出血模型，随机分成假手术组、单纯脑出血实验组，分别按1d、7d、14d、21d分为4个亚组，观察不同时间点大鼠神经功能评分，取脑组织行免疫荧光双标检查Nestin与BrdU共表达情况，免疫组化TGF-β表达。对所得数据进行统计分析，观察脑出血灶周神经保护的作用。
　　结果:第一部份:SFN处理激活Nrf2大鼠组脑出血后与单纯脑出血组比较，神经功能障碍明显减轻;与单纯脑出血组及比较，SFN处理激活Nrf2大鼠组免疫荧光、western blot检测Nrf2转录因子、HO-1抗氧化蛋白表达均升高，于72h达高峰值，SFN处理激活Nrf2大鼠组NF-κB表达下降，免疫组化检测脑出血小胶质细胞活化明显;RA处理脑出血组大鼠死亡率最高，神经功能损伤严重，检测Nrf2转录因子、HO-1抗氧化蛋白表达均较SFN干预组和单纯脑出血组低，持续性抑制作用可能持续5天左右，RA处理抑制Nrf2大鼠组NF-莨B表达下降，免疫组化检测提示脑出血小胶质细胞活化明显且持续时间至5天。第二部分:本实验可观察到:1）单纯脑出血组免疫双标阳性细胞于7d开始有表达，持续性增多至21d，2）而假手术组较单纯脑出血组在7d、14d、21d免疫双标阳性细胞少，差异均有统计学意义(P＜0.01)。说明脑出血后的确有内源性神经干细胞的激活增殖。3）假手术组TGF-β在细胞质中有较少的表达。单纯脑出血组TGF-β阳性细胞在1d时无明显增多，于3d开始增多，可见大量浆着色的阳性细胞，7d达高峰，持续性增多至21d。说明脑出血后TGF-β的表达与内源性神经干细胞相关，可能参与内源性神经干细胞的激活增殖。
　　结论:1）大鼠脑出血后存在急性炎症损伤;2）莱菔硫烷激活Nrf2-ARE信号通路可提高HO-1、NQO1抗氧化酶表达，减轻脑出血后灶周炎性反应，提高神经保护作用;3）小胶质细胞在脑出血早期活化后具有神经毒性作用;4）脑出血后有ENSCs激活、增殖，于7-21天呈逐渐增多的趋势;5）TGF-β信号通路可能参与脑出血后ENSCs激活、增殖。

目录

声明

摘要

中英文对照与缩略词一览表

第一部分：Nrf2-ARE信号通路对脑出血灶周神经保护作用的机制研究

1 前言

1．1脑出血后灶周损伤的关键机制

1．2 NF-κB活化和小胶质细胞的激活与脑出血灶周损伤的关系

1．3 Nrf2-ARE通路调节内源性抗氧化和神经保护作用

1．4 HO-1介导神经保护

1．5 目前待解决的问题及研究意义

2 材料与仪器

2．1 材料

2．2 仪器

3 实验方法

3．1 大鼠脑出血模型建立及MRI鉴定

3．2 给药剂量及途径

3．3 实验分组及取材

3．4 神经功能评分

3．5 免疫组织化学检查Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表达步骤

3．6 Western blot检测步骤

3．7 免疫荧光检查步骤

3．8 统计学处理

4 结果

4．1 大鼠脑出血MRI扫描

4．2 神经功能评分

4．3 Nrf2、HO-1、NF-κB在脑出血大鼠脑组织的表达变化

4．4 免疫组化检测脑出血灶周CD11b阳性细胞表达

4．5 免疫荧光双标检查Nrf2、HO-1共表达

4．6 Western blot法显示Nrf2、HO-1蛋白表达

5 讨论

5．1 自体股动脉血建立大鼠尾状核脑出血模型

5．2 Nrf2-ARE通路调节内源性抗氧化和神经保护

5．3 HO-1在脑出血后具有神经保护作用

5．4 HO-1抑制NF-κB的作用

5．5 脑出血后小胶质细胞的神经毒性和神经保护作用

6 结论与展望

第二部分：大鼠脑出血后内源性神经干细胞激活的机制研究

1 前言

1．1 脑出血后内源性神经干细胞的激活、增殖

1．2 脑出血后ENSCs迁移和分化

1．3 ENSCs的增殖、迁移和分化与TGF-β信号通路的相关机制

1．4 目前待解决的问题及研究意义

2 材料与仪器

3 实验方法

3．1 大鼠脑出血模型建立及MRI鉴定

3．2 给药剂量及途径

3．3 实验分组及取材

3．4 神经功能评分

3．5 免疫荧光检查

3．6 免疫组织化学检测TGF-β

3．7 统计学处理

4 结果

4．1 大鼠脑出血MRI扫描

4．2 神经功能评分

4．3 Nestin与BrdU免疫双标在脑出血大鼠脑组织的表达变化

4．4 免疫组化检测胞浆TGF-β表达差异

5 讨论

5．1 脑出血与内源性神经干细胞

5．2 内源性神经干细胞与TGF-β的关系

6 结论及展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述