嗜酸乳杆菌S-层蛋白的提取鉴定及其相关免疫功能研究

摘要

嗜酸乳杆菌 S-层蛋白作为细菌一种常见的表面蛋白，起着维持菌体形态、参与宿主肠道组织的黏附、入侵及传导信号等作用，本研究通过对 S-层蛋白的提取，研究了其对肠道免疫的调节功能。采用高浓度溶剂法(氯化锂/盐酸胍)、溶菌酶结合氯化锂法提取三株乳酸杆菌的表层蛋白，并通过SDS-PAGE比较蛋白提取效果的差异，选取合适的提取方法及菌株。凝胶过滤层析对实验菌株的表层粗蛋白进行纯化，MALDI-TOF-TOF对纯化蛋白进行二级质谱鉴定。利用透射电镜嗜酸乳杆菌细胞壁结构进行观察，扫描电镜观察 S-层蛋白及嗜酸乳杆菌表面形态。研究结果表明高浓度溶剂法用于提取表层蛋白特异性强，更便于纯化及分离，嗜酸乳杆菌 ATCC4356表层粗蛋白经层析纯化后，质谱结果证实此纯化蛋白为46 kDa的S-层蛋白，S-层蛋白位于嗜酸乳杆菌细胞壁的最外层，蛋白表面较光滑但多褶皱和突起，有助于维持乳杆菌的正常形态。
　　为进一步探究 S-层蛋白的黏附及免疫功能，测定去除 S-层蛋白前后嗜酸乳杆菌的自我凝集率，用 FITC(异硫氰酸荧光素)标记嗜酸乳杆菌，通过荧光显微镜观察去除 S-层蛋白前后乳杆菌对 HT-29细胞的黏附情况的变化，不同的S-层蛋白浓度下，采用酶联免疫法测定 HT-29细胞分泌 IgA的变化，MTS法、溶酶体荧光探针分别测定巨噬细胞 RAW264.7增殖及溶酶体分泌量的变化。结果表明：去除嗜酸乳杆菌的S-层蛋白，菌体自我凝集率降低，乳杆菌对 HT-29细胞的黏附量明显减少，菌体的FITC荧光强度也变低。随着 S-层蛋白的增加，HT-29细胞免疫球蛋白 IgA的分泌量增加；MTS法及溶酶体荧光探针测试结果也表明S-层蛋白能促进巨噬细胞增殖及其溶酶体的分泌。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

引言

1绪论

1.1乳酸杆菌及其表面因子

1.2乳酸杆菌S-层蛋白

1.3 S-层蛋白功能概述

1.4 S-层蛋白的应用前景

1.5立题意义及研究内容

2乳酸杆菌S-层粗蛋白的提取

2.1材料与仪器

2.2试验方法

2.3试验结果

2.4结论

3乳酸杆菌S-层蛋白的纯化及鉴定

3.1材料与试剂

3.2实验方法

3.3试验结果

3.4结论

4S-层蛋白对嗜酸乳杆菌表面形态的影响

4.1材料与试剂

4.2试验方法

4.3试验结果

4.4结论

5S-层蛋白的细胞黏附及免疫实验

5.1试剂与材料

5.2试验方法

5.3试验结果

5.4结论

6结论

6.1 S-层蛋白的提取及鉴定

6.2 S-层蛋白对菌体结构的支撑功能

6.3 S-层蛋白参与乳酸杆菌对肠道细胞的黏附

6.4 S-层蛋白促进细胞免疫功能的发挥

6.5研究展望

参考文献

在学研究成果

致谢