水稻抗黑条矮缩病毒基因组片段S9的原核表达及其转基因研究

摘要

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streded dwarf virus，RBSDV)隶属呼肠孤病毒科斐济病毒属，其基因组由10条双链RNA组成，按其在PAGE上的迁移率由慢到快，依次为S1-S10。其中RBSDV基因组片段S9长1900nt，为双顺反子，分别编码两个蛋白：P9-1与P9-2。由RBSDV引起的水稻黑条矮缩病严重危害我国水稻生产，造成发病地区水稻减产甚至颗粒无收，但是国内外尚缺乏抗黑条矮缩病毒的水稻品种。 本研究根据已报道的序列，设计了RBSDV特异性表达引物，通过PCR扩增了RBSDV的S9-1基因，克隆至载体pGEM-T，并测序鉴定。随后构建了该基因的原核表达载体为pSBET-S9-1。SDS-PAGE分析表明， IPTG诱导的该原核表达质粒在大肠杆菌BL21plysS中高效表达了P9-1蛋白(36.4 kDa)。利用纯化的P9-1蛋白免疫小鼠，制备了P9-1蛋白的抗血清。Western blot分析表明该抗血清具有较高的特异性，与RBSDV病株有强烈的血清学反应。 同时，通过设计引物克隆了RBSDV的S9全长基因，将该基因插入到由pBIl21和pCAMBIA-1301构建的中间表达载体，经过酶切及PCR等分子鉴定，成功地构建了RBSDV S9基因的植物表达载体，并将其转化到根癌农杆菌EHA105中。随后，通过农杆菌介导法将S9基因转入秀水04水稻品种中，得到了68株转基因水稻。PCR结果表明，在94％的水稻植株中检测到S9基因。挑选20株PCR阳性植株做Southern blot检测，在12株植株中杂交到了条带，这表明S9基因已经成功地整合到水稻基因组中，并且多数S9基因在水稻植株中有单个整合位点。 对T1代植株进行PCR和RT-PCR检测结果表明，S9基因已经由T0代稳定遗传到了T1代，并被有效的转录。利用制备的P9-1抗血清对T1代植株进行Westernblot检测，都能检测到相应的条带，表明了S9基因在转基因植株中已经成功表达。

目录

摘要

绪言

第一章文献综述

1.1水稻黑条矮缩病病原病毒研究进展

1.1.1水稻黑条矮缩病的发生分布

1.1.2 RBSDV病毒粒子形态与特性

1.1.3 RBSDV的寄主范围、主要症状和传播介体

1.1.4 RBSDV基因组结构

1.2植物抗病毒基因工程

1.2.1利用非病毒来源的抗病毒基因

1.2.2利用病毒来源的抗性基因

1.2.3多基因策略

1.2.4展望

第二章水稻黑条矮缩病毒P9-1蛋白的原核表达、抗血清制备及其特性

2.1材料

2.1.1材料

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.2方法

2.2.1 PCR扩增

2.2.2 PCR产物的切胶纯化

2.2.3克隆载体pGEM-S9-1的构建

2.2.4阳性克隆的鉴定

2.2.5原核表达载体pSBET-S9-1的构建

2.2.6阳性克隆的鉴定

2.2.71PTG诱导表达

2.2.8 SDS-PAGE检测目的基因的表达

2.2.9抗血清制备

2.2.10 Western blot检测抗血清纯度

2.3结果与分析

2.3.1表达载体pSBET-S9-1的构建

2.3.2 P9-1蛋白表达的诱导及优化

2.3.3 Western blot检测

第三章黑条矮缩病毒S9基因表达载体的构建

3.1材料

3.1.1农杆菌菌株及质粒等

3.1.2酶和化学试剂

3.1.3引物

3.1.4主要培养基

3.1.5基本溶液的配制

3.2方法

3.2.1 PCR扩增

3.2.2 PCR产物的切胶纯化

3.2.3克隆载体pMD-S9的构建

3.2.4阳性克隆的鉴定

3.2.5植物表达载体pRR-S9的构建

3.2.6植物表达载体pRR-S9的农杆菌转化

3.2.7重组转化子的PCR鉴定

3.3结果与分析

3.3.1 RBSDV-S9基因的扩增及克隆

3.3.2中间表达载体的构建

3.3.3植物表达载体的构建

3.3.4植物表达载体pRR-S9的酶切鉴定和PCR鉴定

3.3.5重组双元载体转化农杆菌及PCR验证

3.4讨论

第四章水稻黑条矮缩病毒S9基因对水稻的遗传转化

4.1材料

4.1.1水稻品种和农杆菌菌株等

4.1.2酶和化学试剂

4.1.3培养基的配制

4.1.4各种激素、抗生素的配制

4.2方法

4.2.1农杆菌介导的水稻遗传转化

4.2.2水稻总DNA的大量提取

4.2.3水稻总DNA的小量提取

4.2.4 PCR鉴定

4.2.5 Southern blot分析

4.2.6 RT-PCR检测

4.2.7 Western blot分析

4.3结果与分析

4.3.1水稻的转化

4.3.2 T0代转基因水稻的检测

4.3.3 T1代转基因水稻的检测

4.4讨论

4.4.1农杆菌的转化条件

4.4.2抗生素浓度对分化的影响

4.4.3转基因情况

第五章结论与进一步研究的建议

5.1结论

5.2进一步研究建议

致谢

参考文献

硕士研究期间发表的论文