一种抗黑条矮缩病载体及抗黑条矮缩病转基因水稻培育

摘要

本发明公开了一种抗黑条矮缩病载体及抗黑条矮缩病转基因水稻培育。本发明的抗黑条矮缩病专用载体p1301/Ubi-S6RNAi包括常用的植物RNAi载体p1301/Ubi-RNAi的基本骨架和转移T-DNA区，其特征在于在转移T-DNA区中增加了S6RNAi片段。本发明将p1301/Ubi-S6RNAi载体应用于培育抗黑条矮缩病转基因水稻，其特征在于本发明载体中的S6RNAi片段导入黑条矮缩病感病水稻中，可明显提高转基因水稻对黑条矮缩病的抗性。本发明的载体可广泛应用于提高水稻对黑条矮缩病的抗性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗水稻黑条矮缩病的专用载体。

背景技术

水稻黑条矮缩病RBSDV病是一种主要由灰飞虱作为虫媒传播的病毒病，近年来，该病害在江苏、浙江等长江中下游稻区猖獗流行，造成了巨大经济损失。培育抗病品种是控制病害流行的最经济有效的方法，但是迄今未发现优异的抗病种质或抗病基因资源，使得依靠传统技术的抗黑条矮缩病育种无法开展。

近20年来，人类对付病毒危害的最主要方法就是转基因技术。自从Powell等将病毒外壳蛋白基因在转基因烟草中表达而使烟草获得一定程度的抗TMV病毒侵染以来，大量的病毒基因及其片段都被证明可以诱导植物对相应病毒产生有效抗性的基因。该转基因方法的主要过程是，将病毒的外壳蛋白等基因进行克隆和重组，然后转入植物细胞内，使得转基因植株获得抗病毒的能力，但至今仍不清楚该方法使得植株产生抗性的分子机制。上世纪末，RNA干扰RNAi技术的出现及随后的发展，为人类控制植物病毒病提供了一种高效方便的方法。目前利用RNAi技术控制植物病毒病的最主要技术过程是，在宿主植物体内表达基于病毒基因组序列为靶位点设计的RNAi片段，利用该片段在宿主体内表达以沉默入侵病毒基因组中的特定基因表达，从而影响病毒复制，使得宿主产生抗性。与以往技术相比，RNAi技术产生的抗病毒效应具有高度特异性，对非同源基因表达几乎没有影响，且产生的抗病毒效果好。目前，该技术已被普遍应用于植物抗病毒转基因研究中。

Wang等（2000）以大麦黄矮病毒的复制酶为目的靶基因位点构建RNAi载体并转化大麦，获得了抗黄矮病的转基因大麦。马中良（2004）等根据水稻矮缩病毒RDV序列，构建了与其相关的RNAi载体并转化水稻，获得了对水稻矮缩病毒抗性有所提高的转基因水稻。钟环（2006）以病毒基因组中的SP基因和CP基因为靶标，分别构建了RNAi载体，转入不同水稻品种中均成功的提高了水稻对条纹叶枯病的抗性。然而，大量的研究还发现，针对病毒的不同基因或同一基因的不同靶位点设计产生的RNAi片段，转入宿主植物后所产生的干扰效果，彼此间差异明显。这就要求，在针对具体的病毒RNAi转基因研究中，需要筛选到合适的RNAi片段，以达到最好的抗病毒病效果。

水稻黑条矮缩病毒的基因组由10条线性的双链RNA即dsRNA组成，根据其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移距离，由小到大分别命名为S1-S10。研究结果表明RBSDV的基因组全长为29141bp，至少含有13个开放阅读框 ORF，除了S5、S7和S9均含有2个顺反子之外，其余7个基因组片段均为单顺反子。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种包含特定RNAi片段的可有效控制水稻黑条矮缩病的专用载体，并应用该载体培育抗黑条矮缩病转基因水稻，为通过转基因技术培育抗黑条矮缩病水稻新品种提供基因资源。

为了解决以上技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种抗黑条矮缩病载体p1301/Ubi-S6RNAi，包括常用的植物RNAi载体p1301/Ubi-RNAi的基本骨架和转移T-DNA区，其特征在于在转移T-DNA区中增加了S6RNAi片段，其具体由S6(1)、内含子和S6(2)共三个片段串联组成。

所述的S6(1)片段是通过特异PCR引物扩增黑条矮缩病病毒侵染稻株的cDNA所得，特异PCR引物S6F序列为5’ CGGGATCCCTCGAATC ATCCGTCACTTCTGAGT 3'，S6R序列为5’ GGACTAGTGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'；S6(1)片段序列为ctcgaatcatccgtcacttctgagtGttctaattcgaaaaaacgctacgcacgtccatctaacaaaActtctcctcaacctaactcttcTgaatcatcCaatgaAactaaactgcGtcaGaatttgatttcttctgcttcaaattcctccgtggtgatgaaacctaattcagacgtactcaacctgtcCaaaactcaaactatccttccttctttagttgtgaatgccacttgccagCtacgaatgaaaaatctcgataattggaaaggttttgtccActAgtc。

所述S6(2)片段为S6(1)的反向互补片段；S6(2) 片段序列为gacTagTgga caaaacctttccaattatcgagatttttcattcgtaGctggcaagtggcattcacaactaaagaaggaaggatagtttgagttttGgacaggttgagtacgtctgaattaggtttcatcaccacggaggaatttgaagcagaagaaatcaaattCtgaCgcagtttagtTtcattGgatgattcAgaagagttaggttgaggagaagTtttgttagatggacgtgcgtagcgttttttcgaattagaaCactcagaagtgacggatgattcgag。

所述的S6RNAi片段为S6(1)片段、内含子片段和S6(2)片段串联所得；所述 S6RNAi的片段序列为TtcgaatcatccgtcacttctgagtGttctaattcgaaaaaacgctacgcacgtccatctaacaaaAc ttctcctcaacctaactcttcTgaatcatcCaatgaAactaaactgcGtcaGaatttgatttcttctgcttcaaattcctccgtggtgatgaaacctaattcagacgtactcaacctgtcCaaaactcaaactatccttccttctttagttgtgaatgccacttgccagCtacgaatgaaaaatctcgataattggaaaggttttgtccActAgtcgtaattaagcaaaacttatccaaaaccaaacattttactattattttgacctttttattccacttttcttagacaatgatttaacctcgtaatcaattgttaggacTagTggacaaaacctttccaattatcgagatttttcattcgtaGctggcaagtggcattcacaactaaagaaggaaggatagtttgagttttGgacaggttgagtacgtctgaattaggtttcatcaccacggaggaatttgaagcagaagaaatcaaattCtgaCgcagtttagtTtcattGgatgattcAgaagagttaggttgaggagaagTtttgttagatggacgtgcgtagcgttttttcgaattagaaCactcagaagtgacggatgattcgag。

一种利用上述载体进行抗黑条矮缩病转基因水稻的培育，其特征在于：首先将所述载体p1301/Ubi-S6RNAi转入农杆菌EHA105；其次采用携带所述载体p1301/Ubi-S6RNAi的EHA105菌系侵染水稻，通过农杆菌介导转化法，将载体p1301/Ubi-S6RNAi中的S6RNAi片段转入水稻；最后通过特异PCR引物鉴定转基因水稻中携带有S6RNAi片段，含有S6RNAi片段的转基因水稻，在使用特异引物S6F1和S6R1进行PCR扩增时，可获得一条284bp的特异条带；S6F1引物序列为5’ CTCGAATCATCCGTCACTTCTGAGT 3'，S6R1引物序列为5’ GGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'。

本发明具有有益效果。本发明获得的包含S6RNAi片段的专用载体p1301/Ubi-S6RNAi，转入任何水稻，可从转基因再生植株中筛选到对黑条矮缩病抗性显著增强的转基因水稻，表明本发明的包含S6RNAi片段的专用载体可用于培育抗黑条矮缩病转基因水稻。

 

附图说明

图1为含有S6RNAi片段的抗水稻黑条矮缩病专用载体结构示意图

注：图A为特异PCR引物S6F和S6R的扩增效果；泳道1、2、5号中的DNA模板为染病稻株cDNA，可扩增出S6(1)片段，泳道3、4、6号为健康稻株cDNA，扩增不出S6(1)片段；M为分子量标准。图B为专用载体p1301/Ubi-S6RNAi的双酶切（BamH I和Sac I）结果；正确的重组质粒在双酶切后应出现771bp的特异条带；M为分子量标准；泳道1-3号依次为来自不同单克隆的重组质粒p1301/Ubi-S6RNAi的酶切结果。图C为专用载体p1301/Ubi-S6RNAi的结构示意图； 结构元件中除了S6RNAi区段为本载体特有之外，其它结构元件如LB、RB、GUS、35S、Ubi、NOS、Hyg^R和Kan^R以及其它载体骨架均来自原植物表达载体p1301/Ubi-RNAi。

图2为含有S6RNAi转基因水稻PCR检测及对黑条矮缩病的抗性效果图

注：图中A为包括S6RNAi转基因株系在内的其它转基因株系以及未转基因对照，在江苏4个不同实验地点中的抗黑条矮缩病自然鉴定结果，图中S1、S2、S6和S10分别表示含有S1RNAi、S2RNAi、S6RNAi和S10RNAi干扰片段的转基因株系；CK为未转基因对照株系；图中B为采用特异PCR引物S6F1和S6R1检测转基因再生植株中是否含有S6RNAi片段，其中CK1和CK2分别表示阳性和阴性对照，泳道1、2、4、8～14、16、17、19～22号为S6RNAi阳性转基因植株，其它为阴性转基因植株。

 

具体实施方式

实施例一：载体p1301/Ubi-S6RNAi实施例

载体p1301/Ubi-S6RNAi中包含由S6(1)、内含子和S6(2)共3个片段串联组成的S6RNAi片段; S6(1)片段是通过特异PCR引物扩增黑条矮缩病病毒侵染稻株的cDNA所得； S6(2)片段为S6(1)的反向互补片段；S6RNAi片段由S6(1)片段、内含子片段和S6(2)片段按顺序串联所得，之后导入植物表达载体中获得p1301/Ubi-S6RNAi；含有S6RNAi片段的转基因水稻，在使用特异引物S6F1和S6R1进行PCR扩增时，可获得一条284bp的特异条带，对黑条矮缩病的抗性显著增强。

获得的专用载体p1301/Ubi-S6RNAi，其示意图如图1所示，是在p1301/Ubi-RNAi载体中插入 S6RNAi片段后获得。

通过特异PCR引物扩增黑条矮缩病病毒侵染稻株的cDNA得S6(1)片段。S6(1)片段序列为ctcgaatcatccgtcacttctgagtGttctaattcgaaaaaacgctacgcacgtccatctaacaaaActtctcctcaacctaactcttcTga atcatcCaatgaAactaaactgcGtcaGaatttgatttcttctgcttcaaattcctccgtggtgatgaaacctaattcagacgtactcaacctgtcCaaaactcaaactatccttccttctttagttgtgaatgccacttgccagCtacgaatgaaaaatctcgataattggaaaggttttgtccActAgtc。

特异PCR引物为S6F和S6R，其序列分别为 S6F：5’ CGGGATCCCTCGA ATCATCCGTCACTTCTGAGT 3'，和S6R：5’ GGACTAGTGGACAAAACCTTTCCAATTA TCGAG 3' 。

感染黑条矮缩病水稻植株的总RNA反逆转录成cDNA，其反转录反应体系为20ul，包括2ul的总RNA、0.5μL的引物Oligo dT、4.0μL的5倍反应缓冲液、5.0μL、0.5μL的RNA酶抑制剂、1.0μL的DTT、1.1μL的反转录酶RTase、8.9μL的DEPC处理过的ddH₂O。反转录反应程序为50oC 50 分钟、85oC 5分钟、-20 oC保存备用。

特异PCR引物S6F和S6R扩增S6(1)片段的反应体系为20μl，包含2μl即100ng模板cDNA、2μl的10×聚合酶缓冲液、0.4μl的10mM dNTP；0.4μl 的10μM前后引物，1μl的高保真聚合酶、13.8μl的超纯水；PCR反应条件为：在94℃下预变性5 分种；在94℃下变性 30秒，在60℃下退火30 秒，在72℃延伸1 分种，循环35次；在72℃下延伸5 分钟；12℃保温2小时；目标片段-20℃储存备用。

S6(2)片段为S6(1)的反向互补片段。获得过程按以下步骤进行：（1）利用BamH I和SpeI分别双酶切S6(1)片段和中间载体p1022，通过T4连接酶将酶切后的S6(1)片段连接至p1022载体中，获得重组载体p1022-S6(1)；（2）利用XbaI和Bg1II双酶切重组载体p1022-S6(1)，通过T4连接酶将步骤（1）中酶切后的S6(1)片段连接至重组载体p1022-S6(1)中，由于XbaI与SpeI、BamH I与Bg1II分别同尾酶，因此导入p1022-S6(1)载体的片段为S6(1)的反向互补片段，命名为S6(2)，同时获得重组载体p1022-S6RNAi。

S6(2)的片段序列为：gacTagTggacaaaacctttccaattatcgagatttttcattcgtaGctggcaagtggcattcaca actaaagaaggaaggatagtttgagttttGgacaggttgagtacgtctgaattaggtttcatcaccacggaggaatttgaagcagaagaaatcaaattCtgaCgcagtttagtTtcattGgatgattcAgaagagttaggttgaggagaagTtttgttagatggacgtgcgtagcgttttttcgaattagaaCactcagaagtgacggatgattcgag。

S6RNAi片段为S6(1)片段、内含子片段和S6(2)片段按顺序串联所得。实验中采用的中间载体p1022自身带有水稻谷蛋白基因Gt1的第二个内含子片段，且BamH I和SpeI位于内含子左侧、XbaI和Bg1II位于内含子右侧，因此，通过步骤（2）中的酶切连接，自然获得S6(1)片段、内含子片段和S6(2)片段按顺序串联所得的片段S6RNAi。

     S6RNAi的片段序列为：TtcgaatcatccgtcacttctgagtGttctaattcgaaaaaacgctacgcacgtccatctaac aaaActtctcctcaacctaactcttcTgaatcatcCaatgaAactaaactgcGtcaGaatttgatttcttctgcttcaaattcctccgtggtgatgaaacctaattcagacgtactcaacctgtcCaaaactcaaactatccttccttctttagttgtgaatgccacttgccagCtacgaatgaaaaatctcgataattggaaaggttttgtccActAgtcgtaattaagcaaaacttatccaaaaccaaacattttactattattttgacctttttattccacttttcttagacaatgatttaacctcgtaatcaattgttaggacTagTggacaaaacctttccaattatcgagatttttcattcgtaGctggcaagtggcattcacaactaaagaaggaaggatagtttgagttttGgacaggttgagtacgtctgaattaggtttcatcaccacggaggaatttgaagcagaagaaatcaaattCtgaCgcagtttagtTtcattGgatgattcAgaagagttaggttgaggagaagTtttgttagatggacgtgcgtagcgttttttcgaattagaaCactcagaagtgacggatgattcgag。

将S6RNAi片段导入植物表达载体p1301/Ubi-RNAi中，获得专用载体p1301/Ubi-S6RNAi，具体方法为：通过BamHI和SacI分别双酶切重组载体p1022-S6RNAi和植物表达载体p1301/Ubi-RNAi，酶切产物凝胶电泳后采用凝胶回收试剂盒回收S6RNAi片段和p1301/Ubi-RNAi载体，通过T4连接酶，将S6RNAi片段导入p1301/Ubi-RNAi载体，获得重组载体p1301/Ubi-S6RNAi，即本发明的专用载体p1301/Ubi-S6RNAi。

含有S6RNAi片段的转基因水稻培育，培育方法为：（1）将专用载体p1301/Ubi-S6RNAi转入农杆菌，通过农杆菌介导法将载体中的S6RNAi片段转入水稻，获得候选转基因植株；（2）通过特异PCR引物S6F1和S6R1扩增候选转基因植株的总DNA，如果扩增获得一条284bp的特异条带，则证明目标植株为阳性转基因植株，携带S6RNAi片段，否则为不含有S6RNAi片段的阴性植株。

特异PCR引物S6F1的序列为5’ CTCGAATCATCCGTCACTT CTGAGT 3'，S6R1的序列为5’ GGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'。PCR反应体系为20μl，包含2μl即100ng的再生植株总DNA、2μl的10×聚合酶缓冲液、0.4μl的10mM的dNTPs；0.4μl 的10μM的S6F1引物，0.4μl 的10μM的S6R1引物、1U的DNA聚合酶、13.8μl的超纯水。PCR反应条件为：在94℃下预变性5 分种；在94℃下变性 30秒，在60℃下退火30 秒，在72℃延伸1 分种，循环35次；在72℃下延伸5 分钟；12℃保温10分钟后用于凝胶电泳；凝胶电泳中出现284bp的电泳条带，表明目标植株中携带S6RNAi片段，为阳性转基因植株。

对含有S6RNAi片段的阳性转基因植株，测定其对黑条矮缩病的抗性水平，判断S6RNAi控制水稻黑条矮缩病的效果。测定方法为：在多个试验地点种植含有S6RNAi片段的转基因水稻，同样种植未转基因对照，以及转化含有其它病毒基因的特异RNAi片段的转基因水稻；在整个水稻生育阶段不防治黑条矮缩病病毒介体昆虫灰飞虱；水稻抽穗期调查各株系中染病植株和健康株，计算各株系发病率；如果含有S6RNAi片段的转基因水稻的发病率显著低于未转基因对照，则表明本发明的含有S6RNAi片段的专用载体p1301/Ubi-S6RNAi，可有效控制水稻黑条矮缩病。

实施例二：应用载体p1301/Ubi-S6RNAi培育抗黑条矮缩病转基因水稻

下面实施方式进一步说明本发明所述的专用载体p1301/Ubi-S6RNAi可用于培育高抗黑条矮缩病转基因水稻。本发明说明书所举实例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用。即本发明除说明书所举实施方式外，还可以有其他实施方式。

以一个对黑条矮缩病高度感感的水稻品种武陵粳1号为改良对象。研究首先将p1301/Ubi-S6RNAi导入农杆菌中。进而通过农杆菌介导转化法，转化感病水稻品种的愈伤组织。对愈伤组织和携带p1301/Ubi-S6RNAi载体的农杆菌单克隆菌液共培养2天，吸干多余农杆菌菌液后转入含有50mg/L潮霉素的N6培养基上，抗性筛选两轮，每轮20天。选择抗性愈伤至分化培养基上光照培养30天，获得转基因再生植株。对再生植株采用引物S6F1和S6R1进行PCR阳性和阴性检测，保留阳性转基因植株并移栽至大田。对包括S6RNAi转基因株系在内的其它转基因株系以及未转基因对照，在江苏4个不同地点进行抗黑条矮缩病自然鉴定，结果显示如图2和表1所示：S6RNAi转基因株系对黑条矮缩病的抗性水平在不同地点均显著高于对照，且优于其它干扰片段；各材料在不同地点间的平均病级多重比较结果显示，S6RNAi载体的效果极显著高于其它干扰片段；进一步从S6RNAi片段转基因水稻株系中筛选到了3个对黑条矮缩病病毒病近乎免疫的新品系，表明p1301/Ubi-S6RNAi专用载体可用于培育高抗黑条矮缩病转基因水稻。

表1 各载体转基因纯系及对照多点平均病级多重比较