金蒿抗流感滴丸的生物药剂学与药物动力学研究

摘要

目的：
　　（1）建立金蒿滴丸HPLC分析方法，考察一枝蒿酮酸和金丝桃苷的基本理化性质；
　　（2）分别考察金蒿滴丸有效成分在不同pH条件下和胃肠道中的稳定性；
　　（3）采用细胞模型、在体模型、离体模型研究金蒿滴丸小肠吸收机理；
　　（4）体外研究一枝蒿酮酸和金丝桃苷在人肝微粒体和大鼠肝微粒体中的代谢稳定性；
　　（5）金蒿滴丸有效成分在大鼠体内的药物动力学研究，考察中药复方配伍制成剂型后是否改变药物的体内药动学。综合体内、体外研究结果，分析金蒿滴丸口服后胃肠道吸收的特点，阐明中药复方用药的药动学过程。
　　方法：
　　（1）采用摇瓶法测定一枝蒿酮酸和金丝桃苷的表观油水分配系数，采用HPLC法测定一枝蒿酮酸和金丝桃苷的含量；
　　（2）分别测定金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸、金丝桃苷在不同pH介质、人工胃液、人工肠液、动物胃肠道内容物中的稳定性；
　　（3）建立了Caco-2细胞转运模型，从pH、温度、浓度、方向、抑制剂五个方面考察了金蒿滴丸在Caco-2细胞模型中的转运机理；在体肠吸收试验中，分别考察了金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸、金丝桃苷在十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收情况，考察了P-gp抑制剂和MRP1抑制剂对金蒿滴丸小肠吸收的影响；运用外翻肠囊的方法考察了金蒿滴丸在肠黏膜的吸收性质；
　　（4）采用体外肝微粒体温孵的方法，考察一枝蒿酮酸、金丝桃苷在肝微粒体中的代谢稳定性；
　　（5）以口服灌胃和静脉给药两种给药方式，分别给予大鼠一枝蒿酮酸单体、金丝桃苷单体、金蒿滴丸和金蒿提取物。采用HPLC-ESI-MS/MS法，建立了金蒿滴丸体内血药浓度分析方法，测定金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸、金丝桃苷的药动学数据。
　　结果：
　　（1）金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸的油水分配系数logP随着介质pH的升高而显著性降低；而当pH＜5时，金丝桃苷的logP没有显著性差别，当pH＞5时，金丝桃苷油水分配系数logP逐渐降低；
　　（2）金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸在各种介质中8h内均保持稳定，而金丝桃苷在不同pH条件下、人工胃液和人工肠液中均保持稳定，在大小肠内容物、肠粘膜中不稳定，稳定性大小依次为：肠粘膜＞小肠内容物＞大肠内容物，金丝桃苷在灭菌后的胃肠道稳定性显著性提高；
　　（3）Caco-2细胞转运实验中：偏酸性条件下，即pH=5时，一枝蒿酮酸和金丝桃苷细胞转运Papp最高；一枝蒿酮酸和金丝桃苷的转运随温度增加而显著性增加；低浓度时，一枝蒿酮酸细胞转运的Papp随供给液浓度增大而增加，药物浓度大于25g/mL后，药物转运速率不再随浓度增大而增加；金丝桃苷细胞转运的Papp随浓度的增加逐渐减小；一枝蒿酮酸正向转运(A-B)的Papp大于反向（B-A）转运的Papp，金丝桃苷正向转运(A-B)的Papp小于反向（B-A）转运的Papp；ATP抑制剂显著降低一枝蒿酮酸的双向转运，而加入P-gp抑制剂和MRP1抑制剂对一枝蒿酮酸转运的Papp没有影响；加入P-gp抑制剂明显增加了金丝桃苷的正向转运的Papp，同时抑制了药物的反向转运Papp，MRP1抑制剂吲哚美辛和ATP抑制剂叠氮化钠对于金丝桃苷高浓度的转运有显著的抑制作用。在体肠吸收试验中：一枝蒿酮酸、金丝桃苷在的肠吸收随着肠段的往下延伸逐渐降低，加入P-gp抑制剂维拉帕米后，一枝蒿酮酸的Ka和Peff没有显著性改变，而显著降低了金丝桃苷的Ka；加入ATP抑制剂叠氮化钠后，显著降低了一枝蒿酮酸和金丝桃苷在十二指肠的Ka；金蒿提取物、金蒿滴丸中有效成分Ra、Hp在不同肠段的吸收由强至弱的顺序依次为空肠＞十二指肠＞回肠＞结肠。外翻肠囊试验中：金蒿滴丸在肠道的累积吸收量大小排序为：回肠＞空肠＞十二指肠＞结肠，而金丝桃苷单体在肠道的累积吸收量大小为：十二指肠＞空肠＞回肠＞结肠；
　　（4）体外肝微粒体代谢稳定性实验中，在不同浓度的大鼠肝微粒体、人肝微粒体中，一枝蒿酮酸和金丝桃苷的浓度均没有显著性变化；
　　（5）建立了高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)测定金蒿滴丸大鼠体内血药浓度分析方法，所测得的药动学数据表明，一枝蒿酮酸的绝对生物利用度仅有1.47％。口服金蒿滴丸后大鼠达峰浓度Cmax为687.766±207.459ng/mL，显著高于一枝蒿酮酸的12.471±4.35ng/mL(P＜0.05)，生物利用度提高至43.51%。
　　结论：
　　（1）一枝蒿酮酸、金丝桃苷在偏酸性条件下脂溶性增大；
　　（2）金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸稳定性良好，金丝桃苷在与动物粪便共同孵育的厌氧条件下，被菌丛产生的糖苷酶所代谢，稳定性降低，制成剂型后稳定性提高；
　　（3）Caco-2细胞转运实验中：金蒿滴丸有效成分一枝蒿酮酸和金丝桃苷都具有pH依赖性，能量依赖性，是以主动转运载体介导方式为主，被动扩散为辅的混合转运方式，载体具有饱和性，金丝桃苷口服吸收程度低于一枝蒿酮酸。在体单向灌流实验中：由于肠段的pH差异性，主动转运载体存在分布特异性，故一枝蒿酮酸的肠吸收具有肠段吸收特异性，ATP抑制剂显著性抑制了一枝蒿酮酸在小肠上端的吸收；金丝桃苷的肠吸收也具有肠段吸收特异性，P-gp外排蛋白、ATP抑制剂显著抑制了金丝桃苷在小肠上端的吸收；一枝蒿酮酸、金丝桃苷的肠吸收良好。外翻肠囊实验：表明制剂中的其他成分对有效成分的小肠吸收起到一定的作用；
　　（4）大鼠肝微粒体、人肝微粒体P450酶不参与一枝蒿酮酸和金丝桃苷的代谢；
　　（5）药动学结果表明一枝蒿酮酸制成滴丸剂型后，显著性增加其体内吸收，提高生物利用度。

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前言

研究内容

1 一枝蒿酮酸、金丝桃苷单体的基本理化性质研究

1.1 金蒿滴丸中Ra、Hp高效液相色谱分析方法的建立

1.2 油水分配系数的测定

1.3 讨论

2 金蒿滴丸在不同pH条件下及胃肠道中的稳定性

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

3 金蒿滴丸的小肠吸收机理研究

3.1 金蒿滴丸在Caco-2细胞模型中的转运

3.2 金蒿滴丸的大鼠在体肠吸收特性研究

3.3 金蒿滴丸大鼠离体外翻小肠吸收研究

4 一枝蒿酮酸和金丝桃苷在肝微粒体中的代谢稳定性研究

4.1 材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

5 金蒿滴丸有效成分在大鼠体内的药物动力学研究

5.1 材料

5.2实验方法

5.3 实验结果

小结

致谢

参考文献

综述

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