金蒿滴丸及其生产方法和应用

摘要

一种金蒿滴丸及其生产方法和应用，该方法按下述步骤进行：第一步：取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入乙醇回流提取，提取液过滤、放冷、离心，上清液浓缩；第二步：取上述浓缩液，上大孔吸附树脂进行纯化，分段收集流出液，流出液浓缩、干燥制成浸膏粉，备用；第三步：取上述干浸膏粉，与聚乙二醇按一定比例混合，加热熔融，滴制成滴丸。本发明工艺稳定可靠，所得滴丸中有效成分含量稳定。解决了用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂萃取造成的有机溶剂残留对人体危害等问题。本发明方法比现有的技术更适合工业化生产。本发明所得的金蒿滴丸经药效学实验证明具有明显的抗炎镇痛作用，可用于风湿及类风湿性关节炎治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种金蒿滴丸及其生产方法和应用，其涉及一种纯中药制剂，特别是涉及一种治疗风湿及类风湿性关节炎的金蒿滴丸，它根据中医治疗风湿及类风湿性关节炎的特点，采用大孔树脂技术和滴丸剂型，制成一种滴丸剂，具有疗效快，治愈率高的特点。

背景技术

风湿、类风湿性关节炎是一种以关节病变为主的慢性自身免疫性疾病，是严重危害人类健康的常见病、多发病，被列为临床疑难杂症，该病被称为“活着的癌症”。数据显示，全球风湿病患者约4亿，是医学领域中最为庞大的一类疾患。其特征是慢性的炎性关节病变，并伴有全身多个系统受累。未经系统治疗的风湿病可反复迁延多年，最终导致关节畸形、功能丧失，给患者造成很大痛苦。在中国，有2亿多人在不同程度上患有风湿性关节炎或类风湿关节炎，其中较为严重基本丧失劳动能力的有8200万人，较为严重生活基本无法自理的有1100万人。上述这9300万人不仅严重影响了社会生产力的进步，消耗大量医药资源，同时给本人及家庭带来巨大负担。由于风湿、类风湿性关节炎发病率和致残率高，严重危害着人类的身体健康，给无数家庭带来巨大痛苦，受到全世界医学界高度重视，引起了全社会广泛关注。

目前临床上西医治疗风湿及类风湿性关节炎的治疗药物按其范围可分为通用药物和专用药物两大类。通用药物适用于多种风湿病，专用药物只适用于个别疾病。按化学结构和药理特点可分为非甾体抗炎药，甾体抗炎药，慢作用抗风湿病药，细胞毒药物和免疫调节剂。这些药物仅能对症治疗，停药后易复发、疗程长、毒副作用大，有严重的胃肠道刺激症状，长期服用副作用大，病人不易接受。毋庸置疑，研究与开发高效、低毒抗风湿病的药物具有重要意义。因此，利用我国传统医药几千年来在人类防治疾病的结晶，从传统植物药中挖掘开发一种疗效确切、毒副作用低的中药新药是当前众多医药研究者日益关注的方向。

在当今世界回归大自然的潮流中，中药正在世界范围内引起高度重视并得到逐步接受，如临床上应用的雷公藤多苷片，雷公藤总萜片，雷公藤微囊片，雷公藤滴丸，昆明山海棠片等，在治疗风湿及类风湿性关节炎方面均有很好的疗效。目前我国把继续推进中药现代化和天然药物的发展，列入医药行业的主要任务之一，其中抗风湿病类药物的开发及推进藏、蒙、维、傣、彝、苗药等特色民族药物的现代化是天然药物发展的重点内容之一。维吾尔医药是祖国传统医学的重要组成部分，已有2000多年历史，其理论的独特性及临床的有效性已在实践中得到证实，在防治疑难杂症方面积累了很多丰富而宝贵的用药经验。因此，在分析维吾尔民族医药典籍和民间单验方的基础上，结合民间应用中的独特疗效，进行维药的现代研究与开发是推动维药走向现代化，使维药由民间走向市场，造福于各民族群众的有效途径。

发明内容

本发明提供一种金蒿滴丸及其生产方法和应用，克服了现有技术之不足，解决了用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂萃取造成的有机溶剂残留对人体的危害等问题，采用了现代新型的大孔吸附树脂纯化技术，所得金蒿滴丸含有一枝蒿酮酸和总黄酮较高，所得滴丸中有效成分含量稳定，有明显抗炎镇痛作用，可用于风湿及类风湿性关节炎的治疗，且疗效显著，该金蒿滴丸的生产方法易操作，生产成本低。

本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的：一种金蒿滴丸，其原料贯叶金丝桃和一枝蒿药材按重量份计，比例为1∶1；该金蒿滴丸按重量百分比含有10％至20％的一枝蒿酮酸和20％至40％的总黄酮；该金蒿滴丸按下述步骤得到：

第一步：取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入8至12倍量60％至80％乙醇回流提取2至3次，每次1至2小时，合并提取液，提取液过滤、放冷、离心，上清液浓缩得到每毫升含生药0.20克至0.25克的浓缩液；

第二步：取上述浓缩液，上大孔吸附树脂进行纯化，大孔树脂类型为HPD100、HPD400、HPD100A和HPD400A中的一种或一种以上，分段收集流出液，流出液浓缩、干燥制成浸膏粉，备用；

第三步：取上述干浸膏粉，与聚乙二醇按一定比例混合，加热熔融，滴制成滴丸。

下面是对上述技术方案之一的进一步优化和/或选择：

上述第二步按下述步骤进行：取上述浓缩液，过HPD100、HPD400、HPD100A和HPD400A中的一种或一种以上的大孔吸附树脂，树脂径高比为1∶4至1∶10，吸附速度1.0BV至3BV/h，洗脱速度1.0BV至3BV/h，先用3BV至5BV水以3BV至6BV/h的流速洗脱，洗去水溶性杂质，再以30％乙醇洗脱4BV至6BV，70％乙醇洗脱4BV至6BV，收集30％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度在60℃下为1.22至1.25的清膏，再于真空干燥箱中在温度60℃下干燥，得100目的浸膏粉，备用；称取药用基质聚乙二醇，其重量与100目的浸膏粉比例按重量份计为2∶1至3∶1，于70℃至100℃水浴锅上完全熔融后，加入浸膏粉，搅拌混匀后，倒入滴丸机的装料槽中，搅拌，使药液温度达95℃，保温30分钟后，在8厘米至10厘米的滴距下，以20滴/分钟至40滴/分钟的速度滴入冷却液中，待滴丸完全收缩冷凝成型后，取出，用甩油机除去滴丸表面的冷却液即得。

本发明的技术方案之二是通过以下方式得到的：一种金蒿滴丸的生产方法，其原料贯叶金丝桃和一枝蒿药材按重量份计，比例为1∶1；该金蒿滴丸按重量百分比含有10％至20％的一枝蒿酮酸和20％至40％的总黄酮；该金蒿滴丸按下述步骤进行：

第一步：取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入8至12倍量60％至80％乙醇回流提取2至3次，每次1至2小时，合并提取液，提取液过滤、放冷、离心，上清液浓缩得到每毫升含生药0.20克至0.25克的浓缩液；

第二步：取上述浓缩液，上大孔吸附树脂进行纯化，大孔树脂类型为HPD100、HPD400、HPD100A和HPD400A中的一种或一种以上，分段收集流出液，流出液浓缩、干燥制成浸膏粉，备用；

第三步：取上述干浸膏粉，与聚乙二醇按一定比例混合，加热熔融，滴制成滴丸。

下面是对上述技术方案之二的进一步优化和/或选择：

上述第二步按下述步骤进行：取上述浓缩液，过HPD100、HPD100A、HPD400和HPD400A中的一种或一种以上的大孔吸附树脂，树脂径高比为1∶4至1∶10，吸附速度1.0BV至3BV/h，洗脱速度1.0BV至3BV/h，先用3BV至5BV水以3BV至6BV/h的流速洗脱，洗去水溶性杂质，再以30％乙醇洗脱4BV至6BV，70％乙醇洗脱4BV至6BV，收集30％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度在60℃下为1.22至1.25的清膏，再于真空干燥箱中在温度60℃下干燥，得100目的浸膏粉，备用；称取药用基质聚乙二醇，其重量与100目的浸膏粉比例按重量份计为2∶1至3∶1，于70℃至100℃水浴锅上完全熔融后，加入浸膏粉，搅拌混匀后，倒入滴丸机的装料槽中，搅拌，使药液温度达95℃，保温30分钟后，在8厘米至10厘米的滴距下，以20滴/分钟至40滴/分钟的速度滴入冷却液中，待滴丸完全收缩冷凝成型后，取出，用甩油机除去滴丸表面的冷却液即得。

本发明的技术方案之一是通过以下方式得到的：一种上述的金蒿滴丸应用于作为治疗风湿及类风湿性关节炎的中药。

本发明所得的金蒿滴丸不仅含有10％至20％的一枝蒿酮酸，还含有20％至40％的黄酮类成分。该金蒿滴丸的生产方法采用了大孔吸附树脂纯化技术，能同时富集一枝蒿和贯叶金丝桃中的一枝蒿酮酸和总黄酮类成分，该成分均是对于抗炎镇痛有效的成分，工艺稳定可靠，所得滴丸中有效成分含量稳定。该生产方法所需设备简单，使用的材料安全环保，并可通过树脂再生和乙醇回收反复利用，大大的节约了生产成本，同时又解决了用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂萃取造成的有机溶剂残留对人体的危害等问题。本发明所得的金蒿滴丸经药效学实验证明具有明显的抗炎镇痛的作用，可用于风湿及类风湿性关节炎的治疗。

附图说明

附图1为一枝蒿酮酸对照品测定的色谱图。附图2为本发明产品纯化前色谱图。

附图3为本发明产品纯化后色谱图。附图4为本发明产品的总黄酮紫外扫描图。

附图5为本发明产品的总黄酮标准曲线图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步论述：

实施例1，取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入8倍量60％乙醇回流提取2次，每次1小时，合并提取液，提取液过滤、放冷、离心，上清液减压浓缩至每1ml浓缩液含生药0.20g，过HPD100、HPD100A、HPD400和HPD400A中的一种或一种以上的大孔吸附树脂，树脂径高比为1∶4，吸附速度1.0BV/h，洗脱速度1.0BV/h，先用3BV水以3BV/h的流速洗脱，洗去水溶性杂质，再以30％乙醇洗脱4BV，70％乙醇洗脱4BV，收集30％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.22～1.25(60℃)的清膏，再于真空干燥箱中干燥(温度60℃)，得浸膏粉(100目)，备用；称取药用基质聚乙二醇，其重量与浸膏粉(100目)比例按重量份计为2∶1，于70℃水浴锅上完全熔融后，加入浸膏粉，搅拌混匀后，倒入滴丸机的装料槽中，搅拌，使药液温度达95℃，保温30分钟后，在8厘米的滴距下，以20滴/分钟的速度滴入冷却液中，待滴丸完全收缩冷凝成型后，取出，用甩油机除去滴丸表面的冷却液即得。

实施例2，取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，提取液过滤、放冷、离心，上清液减压浓缩至每1ml浓缩液含生药0.22g，过HPD100、HPD100A、HPD400和HPD400A中的一种或一种以上的大孔吸附树脂，树脂径高比为1∶7，吸附速度2.0BV/h，洗脱速度2.0BV/h，先用4BV水以5BV/h的流速洗脱，洗去水溶性杂质，再以30％乙醇洗脱5BV，70％乙醇洗脱5BV，收集30％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.22～1.25(60℃)的清膏，再于真空干燥箱中干燥(温度60℃)，得浸膏粉(100目)，备用；称取药用基质聚乙二醇，其重量与浸膏粉(100目)比例按重量份计为2.5∶1，于80℃水浴锅上完全熔融后，加入浸膏粉，搅拌混匀后，倒入滴丸机的装料槽中，搅拌，使药液温度达95℃，保温30分钟后，在9厘米的滴距下，以30滴/分钟的速度滴入冷却液中，待滴丸完全收缩冷凝成型后，取出，用甩油机除去滴丸表面的冷却液即得。

实施例3，取等量的贯叶金丝桃和一枝蒿药材混合，粉碎成粗粉，加入12倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，提取液过滤、放冷、离心，上清液减压浓缩至每1ml浓缩液含生药0.25g，过HPD100、HPD100A、HPD400和HPD400A中的一种或一种以上的大孔吸附树脂，树脂径高比为1∶10，吸附速度3.0BV/h，洗脱速度3.0BV/h，先用5.0BV水以6.0BV/h的流速洗脱，洗去水溶性杂质，再以30％乙醇洗脱6.0BV，70％乙醇洗脱6.0BV，收集30％和70％乙醇洗脱液，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.22～1.25(60℃)的清膏，再于真空干燥箱中干燥(温度60℃)，得浸膏粉(100目)，备用；称取药用基质聚乙二醇，其重量与浸膏粉(100目)比例按重量份计为3∶1，于100℃水浴锅上完全熔融后，加入浸膏粉，搅拌混匀后，倒入滴丸机的装料槽中，搅拌，使药液温度达95℃，保温30分钟后，在10厘米的滴距下，以40滴/分钟的速度滴入冷却液中，待滴丸完全收缩冷凝成型后，取出，用甩油机除去滴丸表面的冷却液即得。

实施例4，与实施例1或2或3的不同之处在于：实施例4的金蒿滴丸按重量百分比含有10％的一枝蒿酮酸和20％的总黄酮。

实施例5，与实施例1或2或3的不同之处在于：实施例5的该金蒿滴丸按重量百分比含有15％的一枝蒿酮酸和30％的总黄酮。

实施例6，与实施例1或2或3的不同之处在于：实施例6的金蒿滴丸按重量百分比含有20％的一枝蒿酮酸和40％的总黄酮。

实施例7，与实施例1或2或3的不同之处在于：实施例7的金蒿滴丸按重量百分比含有10％至20％的一枝蒿酮酸和20％至40％的总黄酮；

实施例8，对上述实施列1至7所得的金蒿滴丸进行一枝蒿酮酸含量的测定：采用高效液相色谱法检测分析方法。

实验仪器：SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津制造所)

实验药物：一枝蒿酮酸对照品(中国科学院新疆理化技术研究所，批号：030401)；金蒿滴丸。

实验方法：

色谱条件：采用Shimpack ODSC₁₈柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.4％磷酸(50∶50)，检测波长λ＝241nm；柱温：35℃；流速：1.0μg·mL^-1。进样量为10μL。

对照品溶液的配制：用减重法精密称取一枝蒿酮酸对照品4.86mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即制得一枝蒿酮酸对照品贮备溶液(194.4μg·mL^-1)。

供试品溶液的配制：取上述实施列中的金蒿滴丸样品20丸，精密称定，研细，取0.g至25mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液。

含量测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液，根据测得峰面积，按照外标法进行计算。色谱图见附图1至3。

结果：上述实施列1至7所得的金蒿滴丸样品中一枝蒿酮酸含量都在10％至20％的范围内。

实施列8，对上述实施列1至7所得的金蒿滴丸进行总黄酮含量的测定：采用未经显色直接用紫外分光光度法测定金蒿滴丸中总黄酮的含量。具体方法为：精密称取金丝桃苷对照品3.70mg，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即制得金丝桃苷对照品贮备溶液(148μg·mL^-1)，精密吸取上述金丝桃苷对照品贮备液0.1mL，0.3mL，0.5mL，0.7mL和1.0mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含金丝桃苷为1.48，4.44，7.40，10.36，14.8μg·mL^-1的对照品溶液。以甲醇溶液为空白，在最大吸收波长350nm处测定吸光度值A。以对照品浓度(C，μg·mL^-1)为横坐标，A值为纵坐标进行回归，得标准曲线方程为：A＝0.0478C-0.0253。分别精密称取上述实施列中的金蒿滴丸样品0.2g至25mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，超声处理20min，滤过，滤液作为供试品溶液，在350nm处测定吸光度值A，带入上述回归方程，计算出金蒿滴丸样品溶液的浓度，计算上述实施列1至7所得的金蒿滴丸样品中总黄酮的含量都在20％至40％的范围内。

将上述实施列所得的金蒿滴丸进行药效学实验，其结果和过程如下：

试验列1：本发明金蒿滴丸对佐剂性关节炎大鼠原发性病变的抑制作用

取Wistar雄性大鼠60只，体重180±20g，依体重随机分为蒸馏水(DW)对照组、模型组、阳性对照药风湿安泰片组、三个剂量的金蒿滴丸组，每组10只。先以千分卡尺测量每组大鼠右后足跖厚度。各给药组按设定剂量ig给药，每天1次，连续10天，对照组和模型组ig等量的DW，首次给药后1小时，除对照组外，其余各组均在右后足跖皮下注射Freund’s完全佐剂0.1ml。自注射后第2天起，每天以千分卡尺测量大鼠右后足跖厚度，共测10次。计算各组动物在不同时间足跖肿胀度与药物的抑制率，比较各给药组的药效。

肿胀度＝致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度

结果，模型组及给药组动物右后足跖注射佐剂次日肿胀明显，并逐日加重，3天后有所缓解，第8天再度明显。风湿安泰片和金蒿滴丸中、大剂量组均对由Freund’s完全佐剂引起的大鼠原发性炎症反应有明显的抑制作用。各组动物在不同时间足跖肿胀度与抑制率见表1和表2。

试验列2：本发明金蒿滴丸对佐剂性关节炎大鼠继发性病变的治疗作用

取Wistar雄性大鼠60只，体重180±20g，分组同2.1，先以千分卡尺测量每组大鼠右后足跖厚度。除对照组外，其余各组均在右后足跖皮下注射Freund’s完全佐剂0.1ml，致炎后第18天开始各给药组按设定剂量ig给药，对照组和模型组ig等量的DW，连续12天。给药后各组均隔天以千分卡尺测量右后足跖厚度至第30天。计算各组动物在不同时间足跖肿胀度与药物的抑制率，比较各给药组的药效。

肿胀度＝致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度

统计结果表明，风湿安泰片和中、大剂量的金蒿滴丸均对由Freund’s完全佐剂引起的大鼠继发性炎症有明显的治疗作用。各组动物在不同时间足跖肿胀度与抑制率见表3和表4。

试验列3：本发明金蒿滴丸对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重120-150g，依体重性别随机分为模型组、风湿安泰片组、三个剂量的金蒿滴丸组。各给药组按设定剂量ig给药，模型组给予等量DW，每天1次，连续5天。未次给药1h后，给大鼠左后足跖腱膜下注射1％角叉菜胶无菌溶液50ul致炎。分别测定致炎前及致炎后1h、2h、4h、6h、8h左后足跖厚度，以致炎前后足跖厚度之差作为肿胀度。计算各组大鼠足跖肿胀度均值及抑制率，进行组间均数t检验，统计结果表明，金蒿滴丸能不同程度地抑制角叉菜胶致大鼠足跖肿胀。结果见表5和表6。

试验列4：本发明金蒿滴丸对大鼠棉球肉芽肿的影响

取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g。分组同2.3。将20±1mg的棉球高压灭菌，加入氨苄青霉素(10mg/ml)0.1ml/个，于50℃烘干。在乙醚浅麻醉下，无菌操作，于大鼠两侧腋下切口，将两个灭菌棉球分别植入两侧腋窝部皮下，缝合皮肤。术后当天各组开始按设定剂量ig给药，模型组ig等量蒸馏水，每天1次，连续7天。第8天拉颈椎处死大鼠，取出棉球，剔去脂肪组织，经60℃烘干至恒重，减去原棉球重，即为肉芽肿重(mg/100g体重表示)。计算各组肉芽肿重量，进行组间均数t检验，统计结果表明，与模型组比较，金蒿滴丸对大鼠棉球肉芽肿的生成均有明显的抑制作用。结果见表7。

试验列5：本发明金蒿滴丸对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重20±2g，随机分为模型组、风湿安泰片组、三个剂量的金蒿滴丸组，各给药组按设定剂量ig给药，模型组ig等量DW，每天1次，连续3天，于末次给药后1.5h各组小鼠尾静脉注入0.5％的伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g，并立即ip 0.6％的乙酸NS溶液，0.2ml/只。20min后处死小鼠，剪开腹部，用6ml NS分次洗涤腹腔，吸出冲洗液，合并后以NS稀释至10ml，3000rpm离心15min，取上清液于590nm处测吸收度值，进行组间均数t检验，各组OD值统计结果表明，风湿安泰片和金蒿滴丸中、大剂量均可明显抑制小鼠腹腔毛细血管通透性增高。结果见表8。

试验列6：本发明金蒿滴丸对醋酸致小鼠扭体反应的影响

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重20±2g，分组同2.5。各给药组按设定剂量ig给药，模型组ig等量蒸馏水，每天1次，连续3天。于末次给药后2h，每鼠ip 0.6％乙酸NS溶液0.2ml/只。观察记录小鼠15min内扭体次数，进行组间均数t检验，并计算抑制率。统计结果表明，风湿安泰片和金蒿滴丸中、大剂量均可明显降低醋酸致小鼠扭体反应次数。结果见表9。

试验列7：本发明金蒿滴丸对2，4-二硝基氯苯致小鼠耳廓皮肤迟发型超敏反应的影响

取NIH小鼠50只，雌雄各半，体重25±1g，分组同2.5。各给药组按设定剂量ig给药，模型组ig等量蒸馏水，每天1次，连续9天。于给药后第10天各组小鼠左耳涂抹0.25％的2，4-二硝基氯苯丙酮液0.02ml/只，对侧耳廓涂抹相同容积的丙酮液做对照，24h后处死小鼠，从耳根处剪下鼠耳，以打孔器于左、右耳切下相同面积耳片，分别称重，计算左右耳片重量的差值作为肿胀度，进行组间均数t检验，并计算抑制率，统计结果表明，风湿安泰片和金蒿滴丸中、大剂量均可明显抑制2，4-二硝基氯苯至小鼠耳廓迟发型超敏反应。结果见表10。

试验列8：本发明金蒿滴丸对小鼠血清溶血素生成的影响

绵羊红细胞(SRBC)及豚鼠血清的制备：由健康绵羊颈静脉无菌取血50ml，置盛有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，摇动10min以除去纤维蛋白，加入相当于羊血体积两倍的阿氏液，摇匀后置4℃保存备用，临用前以无菌NS洗3次(1500rpm，5min)，弃上清，再以NS作3∶5(V/V)稀释。另从健康豚鼠颈动脉取血制备血清，临用时以无菌NS作1∶10稀释。

取NIH小鼠50只，雌雄各半，体重20±2g，分组同2.5。各给药组按设定剂量ig给药，对照组ig等量蒸馏水，每天1次，连续7天。于末次给药后2小时各组小鼠均ip 10％SRBC悬液0.2ml/只，免疫后第6天取血，放置1h后离心(2000rpm，10min)，取血清，以NS稀释500倍后按下表加样：

各管加样后于37℃水浴保温10min，冰浴终止反应，离心(2000rpm，5min)，取上清1ml，加都氏液3ml，另取10％SRBC悬液0.25ml与4ml都氏液混匀，10min后测吸收值作为SRBC半数溶血吸收值，各样品管以对照管为空白，于540nm测定吸收值，计算样品HC₅₀。统计结果表明，风湿安泰片和金蒿滴丸中、大剂量均可明显抑制小鼠血清溶血素的生成。结果见表11。

HC₅₀＝样品吸收度均值/SRBC半数溶血吸收值×血清稀释倍数

试验列9：本发明金蒿滴丸对T淋巴细胞增殖的影响

常规制备脾细胞悬液：取NIH小鼠摘眼球放血处死，无菌取脾，剔除脂肪及结缔组织，置于100目尼龙布上剪碎，尼龙布置内盛10ml冷HBSS液的培养皿上，剪碎，用匀浆器匀浆，收集细胞液，离心(1000rpm，10min)，弃上清，经低渗(0.8％的NH₄Cl处理)除去红细胞，做细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，以上过程均在0～4℃进行。样品及ConA以RPMI-1640液配成所需浓度，于96孔板按下表加样：

培养板置37℃，5％CO₂孵箱中培养72h后取出，加MTT(10ul/孔)混匀后再培养4～6h，吸弃上清，加DMSO(100ul/孔)，稍振荡使甲臜产物充分溶解，用酶标仪测定各孔OD_570nm值。统计结果表明，ConA对照组细胞增殖程度明显高于空白对照组；与ConA组比较，金蒿滴丸在浓度为1000～2000ug/ml范围内可明显促进T淋巴细胞的增殖。结果见表12。

试验列10：本发明金蒿滴丸对B淋巴细胞增殖的影响

常规制备脾细胞悬液方法同上。样品及LPS以RPMI-1640液配成所需浓度，于96孔板按下表加样：

培养板置37℃，5％CO₂孵箱中培养72h后取出，加MTT(10ul/孔)混匀后再培养4～6h，吸弃上清，加DMSO(100ul/孔)，稍振荡使甲臜产物充分溶解，用酶标仪测定各孔OD_570nm值。实验结果表明，LPS组细胞增殖程度明显高于空白对照组；与LPS组比较，金蒿滴丸在浓度为250～2000ug/ml范围内可抑制B淋巴细胞的增殖。结果见表13。

金蒿滴丸对大鼠佐剂性关节炎、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀以及大鼠棉球肉芽肿均有较好的抑制作用；可降低小鼠腹腔毛细血管通透性、减少醋酸致小鼠扭体反应次数，并抑制小鼠耳廓皮肤迟发型超敏反应；同时可促进小鼠血清溶血素生成，在浓度为1000～2000ug/ml范围内可促进T淋巴细胞的增殖，在浓度为250～2000ug/ml范围内抑制B淋巴细胞的增殖。提示金蒿滴丸具有良好的抗炎、镇痛和免疫调节作用，为其用于治疗风湿及类风湿性关节炎提供了药理学依据。