新疆地区结核分枝杆菌临床分离株致病相关基因的筛选

摘要

目的：筛选新疆地区结核分枝杆菌临床分离株致病相关基因并分析这些基因的功能。 方法；利用抑制消减杂交SSH技术，分别以结核分枝杆菌新疆地区临床分离株和国际标准强毒试验株H37Rv株基因组DNA互为tester和driver，通过两轮两相驱赶彼此相同的大多数基因片段并富集差别片段、连接载体、转化大肠杆菌、蓝白斑筛选阳性克隆、送基因公司测序、登录Genebank对测序结果Blast比对等方法，筛选结核分枝杆菌新疆地区临床分离株和国际标准强毒株H37Rv株之间的差异基因并分析这些基因的功能。 结果：通过正向消减杂交并对所得DNA片段的功能进行分析，在结核分枝杆菌新疆地区临床分离株中存在的DNA片段有6个，这些片段与结核分枝杆菌国际标准临床株CDC1551株以及结核分枝杆菌复合群国际标准株KMS株中的基因高度同源：其中1个与编码平行进化同源基因家族11有关，并与5’-磷酸基吡哆胺氧化酶代谢相关；1个与编码酰基转移酶蛋白家族同源；1个与编码氨基转移酶Ⅱ(脂)酰基载体蛋白同源；1个与黄素单加氧酶结合蛋白家族有关;1个与编码复制起始密码蛋白同源；1个与多萜醇磷酸甘露糖转移酶及mmcH蛋白合成有关。这些基因均与增强结核分枝杆菌在宿主体内存活繁殖以及耐药有关。通过反向消减杂交并对所得DNA片段的功能进行分析，在结核分枝杆菌国际标准强毒试验株H37Rv株基因组中存在的DNA片段有10个，均为Genebank公布的在H37Rv株中存在的已知基因，从另一方面证明了SSH技术在筛选差异基因方面的可靠性。 结论：结核分枝杆菌新疆地区临床分离株与国际标准试验株H37Rv株基因之间存在差异。新疆地区结核分枝杆菌临床分离株增强了在宿主体内存活繁殖以及致病的能力，即增强了吸附、抵抗氮氧合酶消化的能力；加强了细胞壁脂质作用，抵抗各种药物的杀灭；同时增强了从宿主体内获取营养的能力；加强了染色体复制起始密码子功能，促进自身增殖分化；增强了物质代谢以及各种参与重要辅酶、辅基维生素代谢生存必需基因的功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语表

声明

前言

材料与方法

1材料

1.1菌株样本

1.2主要试剂

1.3实验试剂配制

1.4主要仪器设备

1.5实验耗材

2方法

2.1结核分枝杆菌的制备

2.2结核分枝杆菌基因组DNA抽提

2.3结核分枝杆菌基因组DNA

2.4多重P C R法鉴定结核分枝杆菌菌种

2.5 RsaⅠ酶切

2.6酶切DNA纯化

2.7接头连接

2.8接头连接效率检测

2.9双向抑制性差减杂交

2.10两轮PCR富集目的片断

2.11琼脂糖凝胶电泳

2.12差异基因PCR产物纯化

2.13差异基因与载体连接

2.14大肠杆菌感受细胞的制备

2.15差异基因连接产物的转化

2.16阳性转化子的鉴定

2.17阳性转化子的质粒抽提

2.18通用引物扩增目的片断

2.19测序

2.20生物信息学分析

结果

1.结核分枝杆菌基因组DNA抽提结果

2.多重PCR法鉴定结核分枝杆菌菌种结果

3.结核分枝杆菌基因组酶切结果

4.接头连接效率检测结果

5.正反双相消减杂交结果

6.蓝白斑筛选结果

7.阳性转化子的PCR鉴定结果

8.通用引物PCR扩增结果

9.测序结果比对分析结果

讨论

1结核分枝杆菌差异基因筛选的技术方法

1.1多重PCR对分枝杆菌鉴定的特异性

1.2抑制性消减杂交SSH技术与原理

1.3 SSH技术在本项研究中的运用

1.4结核分枝杆菌差异基因测序

2结核分枝杆菌差异基因功能分析

结论

参考文献

文献综述：转座子及其相关技术的研究

简历

致谢

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