河北省结核分枝杆菌临床分离株基因分型、表型耐药及耐药相关基因突变特征研究

摘要

目的：初步探讨结核分枝杆菌散在重复单位-数目可变串联重复序列（Mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats，MIRU-VNTR）技术和间隔区寡核苷酸（Spaceroligonucleotidetyping，Spoligotyping）技术在河北省结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）临床分离株的分子流行病学研究中的应用，初步了解河北省MTB临床分离株的基因型及其分布特征；通过药物敏感试验和耐药基因测序，初步了解河北省MTB临床分离株的耐药情况，探讨表型耐药与耐药相关基因突变之间、基因型与表型耐药之间以及基因型与耐药相关基因突变之间的相关性，评价耐药相关基因位点检测对MTB表型耐药的临床诊断价值，为建立耐药结核分枝杆菌分子生物学快速检测技术提供科学依据。
　　方法：从2014年1月至2014年12月，共收集到1017株河北省MTB临床分离株及相应的病例背景资料。采用PNB/TCH鉴别培养基和多位点PCR进行菌种鉴定，采用L-J固体培养基比例法进行一线抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇）的药物敏感试验，采用15位点MIRU-VNTR和Spoligotyping进行基因分型研究，采用基因测序技术对7个耐药相关基因位点（rpsL、rrs、katG、inhA、oxyR-ahpC间隔区、rpoB和embB）进行序列分析，采用BioNumerics5.0软件进行聚类分析、GraphPadPrism5.0软件进行统计分析。
　　结果：
　　1、河北省MTB菌株对四种一线抗结核药物的总耐药率为34.1％，MDR总耐药率为13.2%。初始耐药率为26.6%，初始MDR耐药率为6.1%；获得性耐药率59.7%，获得性MDR耐药率为37.6%。获得性耐药率和获得性MDR耐药率均分别显著高于初始耐药率和初始MDR耐药率（P值均<0.0001）。
　　2、河北省结核分枝杆菌表现出高度的基因多态性。Spoligotyping显示，北京家族占90.5%，非北京家族占9.5%。非北京家族以T基因型为主，也发现了LAM、MANU、H、U等基因型。MIRU-VNTR将1017株MTB菌株分成16个基因群，共846种VNTR基因型。Spoligotyping和15位点MIRU-VNTR的HGDI值分别为0.279和0.999。
　　3、北京家族与非北京家族在患者年龄、性别、治疗史及表型耐药的分布方面均无统计学差异。北京家族菌株的成簇率显著高于非北京家族菌株的成簇率（P<0.0001）。rpsL、embB基因在北京家族菌株中的突变率显著高于其在非北京家族菌株中的突变率（P值分别为0.0051和0.0180）。
　　4、rpsL基因43位点的突变率为56.0%；rrs基因的突变率为17.0%；katG基因315位点的突变率为62.3%；inhA基因-15位点的突变率为14.1%；oxyR-ahpC间隔区的突变率10.5%；rpoB基因531位点的突变率为53.7%；embB基因306位点的突变率为56.5%。
　　5、随着耐药种类的增加，rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位点的突变率呈递增的趋势（趋势P值均<0.0001）。rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306在MDR菌株中的突变率均显著高于在非MDR菌株中的突变率（P值分别为0.0136、<0.0001、<0.0001和<0.0001）。rpoB526/531和embB306联合检测MDR表型耐药的灵敏度为83.2%，特异度为80.8%。
　　结论：
　　1、河北省MTB菌株对一线抗结核药物的总耐药率及MDR耐药率与全国平均水平相当。MTB菌株耐药性的产生与抗结核药物治疗有关。
　　2、河北省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性，北京家族为主要流行株。15位点MIRU-VNTR基因分型法的分辨能力高于spoligotyping基因分型法的分辨能力。15位点MIRU-VNTR和spoligotyping相结合，能够准确全面地分析河北省结核分枝杆菌的基因多态性。
　　3、北京家族菌株在河北省的近期传播能力比非北京家族更强。rpsL和embB基因突变与北京家族菌株有关，提示链霉素和乙胺丁醇对北京家族菌株的临床治疗效果可能较差，这种适应性代价使北京家族菌株能够更好地适应环境，从基因水平解释了北京家族菌株广泛传播的原因。
　　4、rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位点的突变率随耐药种类增加呈递增趋势。rpoB526/531和embB306联合检测可用于检测MDR表型耐药。

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引言

第一部分 河北省结核分枝杆菌临床分离株基因分型及表型耐药特征

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 河北省结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变特征

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述: 北京家族结核分枝杆菌的研究进展

致谢

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