胃癌相关基因甲基化检测和药物联用去甲基化的研究

摘要

背景：胃癌患者的高死亡率主要因为缺乏胃癌早期诊断的特异性标志物和有效的治疗手段。以往的研究主要集中在肿瘤特异性的基因组DNA序列的改变上，如基因易位、反转、缺失、突变等，但在相当一部分肿瘤患者的癌细胞中，抑癌基因沉默并非基因水平改变所致，而是由于基因启动子区发生了甲基化。在基因表达调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展中，DNA甲基化起着重要作用。基因调节元件内的甲基化，如启动子、增强子等的甲基化，一般会抑制它们的功能。据Knudson的“二次打击学说”，由于甲基化或甲基化与突变、缺失共同作用，使得抑癌基因的两个等位基因完全失活。甲基化酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷嘧啶(5-Aza-2-deoxycytidine，Aza)能逆转肿瘤细胞的基因甲基化，恢复mRNA转录活性和蛋白表达，而且表达水平随细胞的类型和药物剂量的改变而不同，从而证实启动子的甲基化是抑癌基因表达关闭的主要原因。结合肿瘤相关基因的功能研究及甲基化相关基因失活的机制研究，充分证明抑癌基因CpG岛甲基化直接促进恶性行为。因此在肿瘤早期诊断、评估肿瘤风险及预后中，DNA甲基化将成为具有广泛应用前景的分子标志。 近年来在多种肿瘤中观察到P16、E-CD、hMLH1基因启动子区异常甲基化，同时伴随基因转录失活和表达缺失。那么在临床胃癌标本中，胃癌细胞系中，P16、ECD、hMLH1的甲基化状况、基因转录、表达水平如何呢?如果存在转录失活和表达抑制，启动子区甲基化是否是其发生的主要机制呢?去甲基化药物Aza能否针对基因甲基化的靶点发挥疗效呢?Aza联合脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodiumphenylbutyrate，SPB)，能否逆转胃癌细胞系、裸鼠胃癌种植瘤的基因甲基化，并恢复基因转录和表达活性呢?因此，本课题开展对P16、ECD、hMLH1基因在胃癌临床标本、胃癌细胞系、裸鼠胃癌种植瘤中的基因启动子区甲基化检测以及针对该靶点进行去甲基化治疗的研究。 目的：通过研究胃癌组织中，抑癌基因P16、E-CD、hMLH1启动子区5’CpG岛甲基化状况和转录表达水平，来揭示胃癌发生、发展过程中的分子水平变化和可能作用机制，在表基因水平寻找胃癌早期诊断的分子标志物和治疗靶点。探讨在胃癌细胞系、裸鼠胃癌细胞系种植瘤中联合应用Aza和SPB后，对基因甲基化水平、转录、表达以及瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭力的影响，为临床探索肿瘤治疗的新途径提供实验和理论基础。 方法：1.随机收集41例胃癌、40例癌前病变及38例正常胃粘膜。分别用甲基化特异性PCR(methylationspecificpolymerasechainreaction，MSP)、免疫组织化学检测P16、E-CD、hMLH1的5’CpG岛甲基化水平和蛋白表达情况。 2.甲基化酶抑制剂Aza、去乙酰化酶抑制剂SPB及二者联合作用人胃癌细胞系SGC-7901，通过MSP，RT-PCR，蛋白免疫印迹法(Westernblot)，免疫荧光(Immunofluorescence)检测用药前后P16、E-CD、hMLH1的甲基化、mRNA和蛋白表达水平的变化。 3.光镜下直接观察细胞形态变化，MTT法检测细胞生长状态，绘制药物量效曲线。 4.利用流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡情况。 5.HE染色法、DNA梯形条带初步检测细胞凋亡后再用电镜进一步确认。 6.以胃癌细胞株SGC-7901细胞悬液构建裸鼠人胃癌动物模型。 7.将不同浓度的SPB、Aza及二者联合用于胃癌的裸鼠模型，通过MSP，RT-PCR，Western，免疫荧光检测用药前后P16、E-CD、hMLH1的甲基化、mRNA和蛋白表达水平的变化。 8.观察各实验组肿瘤生长情况，HE染色法、电镜检测各实验组胃癌动物模型肿瘤细胞的凋亡情况。 结果：1.P16、E-CD、hMLH1基因启动子区5'CpG岛甲基化阳性率在临床胃癌组织中分别为56.09％(23/41)，19.51％(8/41)，34.15％(14/41)，远高于癌前病变组和正常对照组，有统计学意义(P＜0.05)。 2.P16、E-CD、hMLH1蛋白表达阳性率在临床胃癌组织中分别为51.22％(21/41)，70.73％(29/41)，60.97％(25/41)，远低于癌前病变组和正常对照组，有统计学意义(P＜0.05)。 3.Aza和SPB可逆转胃癌细胞系SGC7901中P16、E-CD、hMLH1基因甲基化，提高上述基因的mRNA转录和蛋白表达。 4.MTT结果显示SPB组、Aza组、联合用药组SGC-7901细胞抑制率分别为54.6％、67.5％、78.7％，与对照组相比，生长明显受抑制。 5.软琼脂克隆试验表明，对照组、SPB组、Aza组、联合用药组的细胞克隆数分别为64.3、27.2、30.5、24.1，用药组细胞克隆形成率显著降低(P＜0.05)。 6.流式细胞术检测结果显示：各用药组的SGC-7901细胞S期及G2/M期细胞比例不同程度下降，G0/G1期细胞增加，细胞增殖指数PI降低，对照和三个用药组中PI分别为：51.53％、48.68％、35.68％和21.76％。 7.细胞侵袭力检测显示：各用药组穿过PET膜的SGC-7901细胞数较对照组显著下降。 8.HE染色、电镜、DNA梯形条带显示各用药组与对照组SGC-7901细胞相比，出现大量凋亡和坏死细胞；有较多的DNA1adder。 9.成功地构建了裸鼠人胃癌动物模型。 10.对照组、SPB组、Aza组、联合用药组裸鼠瘤体体积分别为2.26cm3、1.30cm3、1.17cm3、0.63cm3，与对照组相比，各用药组裸鼠瘤体的体积和重量明显下降(P＜0.05)，瘤体生长抑制率分别在各用药组分别为42.4％、48.23％、72.12％，裸鼠瘤肺转移灶在四个实验组中分别为4/6、1/6、1/6、0/6。 11.HE染色法显示细胞凋亡率由对照组的4.28％升至用药组的5.12％、14.63％、23.22％，电镜下发现大量的凋亡细胞和坏死细胞。 12.SPB、Aza联用可逆转荷瘤裸鼠瘤灶中P16、E-CD、hMLH1基因甲基化，提高上述基因的mRNA转录和蛋白表达水平。联合用药组显著抑制了荷瘤裸鼠肿瘤转移，有更少的肺转移结节，更小的肿瘤体积，更多的凋亡细胞。 结论：1.P16、E-CD、hMLH1基因启动子区甲基化可作为胃癌早期诊断、预后评估的辅助指标之一，有望成为胃癌治疗的新靶点。 2.SPB、Aza及二者联合用药能有效抑制胃癌细胞株SGC-7901体外增殖和裸鼠胃癌移植瘤的肿瘤生长，并调节细胞周期促进凋亡。通过不同程度逆转启动子区甲基化而恢复P16、E-CD、hMLH1表达与基因转录。Aza和SPB有望成为新的有效的抗肿瘤联合用药模式。本研究为甲基化介导的基因沉寂及肿瘤治疗提供了可靠的理论和实验基础。

目录

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英文缩略语

前言

第一部分胃癌中肿瘤相关基因CpG岛高甲基化的研究

第二部分药物联用逆转胃癌细胞系抑癌基因

第三部分药物联用逆转裸鼠胃癌移植瘤抑癌基因甲基化恢复基因表达的研究

个人简历

在学期间承担课题及发表论著

致谢