超微体积生物样品中核酸甲基化及去甲基化的毛细管电泳电喷雾质谱联用(CESI-MS)方法分析

摘要

DNA的甲基化及去甲基化是重要的表观遗传学标志之一.其碱基修饰物5-甲基胞嘧啶(5-mdC)及其氧化产物(5-hmdC,5-fdC和5-cadC)与基因的表达和调控、基因组的结构及稳定性、以及生命体生长发育等多种生物过程紧密相关.1-2近年来,科学家们建立了多种检测这些潜在生物标志物的方法.3-6随着精准医疗的普及以及液体活检的兴起,研究者们对痕量的细胞游离DNA(cfDNA)以及循环肿瘤细胞(CTC)的核酸修饰情况十分关注.针对这些痕量、微体积的样品，检测其DNA的甲基化及去甲基化情况是极具挑战又十分有意义的。本工作便建立了一种利用多孔喷头无鞘液接口的毛细管电泳电喷雾质谱联用（CESI-MS）技术高灵敏检测超微体积生物样品中这些碱基修饰物的方法。该方法有着优异的检出限（LODs低至amol）、线性范围和检测重复性。同时，此方法对5-mdC及其氧化产物有良好的定性及定量检测能力。利用5?L，125pg的小鼠胚胎干细胞基因组DNA（相当于20个细胞中的基因组DNA含量）该方法便可成功定量其中的5-mdC和5-hmdC含量。此用量远低于现有的常规高效液相色谱质谱联用方法。同时，由于毛细管电泳的一个独特的优势是其进样量极小（约为5nL到100nL），通过减小样品总体积（200nL到5?L）还可以进一步减小该方法所需的DNA样品量，以达到超微体积样品检测的最终目标。