遗传性无虹膜致病基因的定位筛查、RNAi介导的PAX6沉默对B3细胞影响的研究

摘要

目的:
　　中国山东、河南遗传性无虹膜两家系致病基因的定位及突变筛查;构建基因PAX6 RNAi载体;探讨基因PAX6沉默对B3细胞的影响。
　　方法:
　　1、致病基因筛查定位。
　　(1)、分别采集山东遗传性无虹膜合并先天性白内障家系、河南遗传性无虹膜家系的临床资料及血液标本，进行经典遗传学分析和细胞遗传学检查。
　　(2)、提取家系成员的基因组DNA，采用定位克隆的策略，对山东家系进行全基因组微卫星标记的扫描，经多重PCR反应，Genescan分析基因型，数据文件在Linkage5.2软件上运算，连锁分析计算Lod Score，单倍体分析，精确定位。对河南家系则在已有研究结果上直接进行该区域定位排查，并进一步精细定位。
　　(3)、从NCBI(National Center for biotechnology Information)等数据库中搜寻定位区域内的候选致病基因的基因序列，设计引物，PCR扩增测序，进行突变筛查。
　　2、PAX6 RNAi载体构建。
　　(1)、选择4个PAX6基因RNA干扰靶序列，设计与之对应的shRNA序列，构建并验证shRNA重组质粒载体，构建过表达外源PAX6融合蛋白的293T细胞模型。用shRNA质粒载体进行外源靶序列筛选。
　　(2)、构建shRNA慢病毒载体，用shRNA慢病毒载体进行内源目标序列筛选，与外源筛选结果共同确定有效的PAX6 RNAi靶序列。
　　3、应用有效的shRNA干扰慢病毒感染B3细胞，观察PAX6基因干扰后对B3细胞的影响。
　　结果:
　　1、致病基因筛查定位。
　　(1)、根据经典遗传学分析，两家系为常染色体显性遗传，细胞遗传学检查未发现染色体异常。
　　(2)、定位克隆把山东家系致病基因定位于微卫星Markers D11S915和D11S4101之间，河南家系致病基因定位于微卫星Markers D11S1755和D11S935之间。
　　(3)、对候选基因PAX6进行PCR双向测序，发现山东家系中PAX6基因的第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变，导致可能的mRNA拼接错误，而河南家系中未发现PAX6基因突变。
　　2、PAX6 RNAi载体构建。
　　(1)、针对候选的4个PAX6干扰靶点，成功构建了PAX6 shRNA的重组质粒载体及表达FLAG tag、PAX6、红色荧光蛋白的融合蛋白表达系统，并在293T细胞上构建了PAX6过表达模型。外源筛靶结果验证了1＃、2＃和4＃靶序列是有效的干扰靶位点。
　　(2)、成功构建了PAX6 shRNA重组慢病毒载体，在表达内源PAX6的晶状体上皮细胞系B3中进行靶点筛选，其结果与外源筛选结果一致，1＃、2＃和4＃shRNA重组慢病毒对PAX6基因均有明显的干扰效果。
　　3、PAX6沉默的B3细胞，凋亡细胞数目异常增加。
　　结论:
　　1、山东家系的PAX6基因在第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变(IVS2-2delA)，导致该家系出现先天性无虹膜及先天性白内障表型。
　　2、河南无虹膜家系的致病基因位点定位在Markers D11S1755和D11S935之间。
　　3、找到了3个PAX6 RNAi的有效靶序列。
　　4、建立了PAX6 RNAi质粒载体及慢病毒载体。
　　5、PAX6基因沉默引起B3细胞过度凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分：经典遗传学分析及细胞遗传学分析

第二部分：致病基因定位

第三部分：遗传性无虹膜致病基因的突变筛查

第四部分 PAX6 shRNA质粒载体的构建验证及有效靶点的外源筛选

第五部分 PAX6 shRNA病毒载体的构建验证、有效靶点的内源筛选及PAX6基因沉默对HLE-B3细胞增殖影响的研究

展望

总结

参考文献

附录一：PAX6基因对发育影响的研究进展(综述)

附录二：RNA干扰：机制及应用(综述)

附录三：在学期间发表论文

致谢