中国河南一先天性无虹膜家系PAX6基因致病性新突变位点的筛查与验证

摘要

背景与目的：
　　先天性无虹膜是临床较为罕见的先天性遗传性眼部疾病，特征表现为双眼虹膜组织发育不良或正常虹膜组织缺如，部分患者伴发黄斑及视神经发育不良、白内障、青光眼、眼球震颤、弱视、斜视、屈光不正等眼部疾病。研究显示，PAX6基因与先天性无虹膜密切相关。全球范围内，先天性无虹膜发病率为1/64000~1/96000，无种族、地区、年龄、性别差异，其中约2/3患者有家族史，约1/3为散发。85％先天性无虹膜为常染色体显性遗传，13%伴发于WAGR综合症，2%为常染色体隐性遗传。
　　资料与方法：
　　收集2014年8月在郑州大学第一附属医院眼二科就诊的一个先天性无虹膜三代家系，共9名成员，其中男性患者2例，女性患者3例，正常家系成员4名。采集9名家系成员血样，同时随机搜集100名与本家系无关的正常健康体检者。所有参与研究人员进行详细的全身检查，排除全身系统性疾病，进行详细的眼部检查，采集眼底、眼前节照相等。
　　使用酚-氯仿法提取血样中的DNA，根据PAX6基因的14个外显子设计引物，进行特定片段的PCR扩增。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，进行双向DNA测序。使用DNAStar软件分析测序结果。
　　使用GeneJETRNA纯化试剂盒提取血样淋巴细胞中的RNA，逆转录成cDNA。利用MaximaSYBRGreenqPCR检测试剂盒进行实时定量荧光PCR。以β-肌动蛋白基因作为参照。配制体系，加样，使用Mx3000P实时荧光定量PCR仪软件读取数据。
　　结果：
　　该家系的遗传方式为明显的常染色体显性遗传，所有患者均表现为单纯的眼部异常不伴有任何全身或其他系统性疾病。家系中5例患者临床表现相似，包括先天性无虹膜、畏光、眼球钟摆样水平震颤，其中3例成年患者患白内障，2例患儿未患白内障。
　　使用DNAStar软件分析测序结果，发现该家系中所有患者的PAX6基因10号外显子发生移码突变，第796位脱氧核糖核苷酸G缺失（c.796delG），导致产生提前终止密码子，但家系正常成员及100名对照者均不存在此突变。
　　实时荧光定量PCR检测比较，家系中先天性无虹膜患者PAX6基因mRNA的水平比家系中正常人PAX6基因mRNA的水平降低约50%。
　　结论：
　　1.本研究中我们发现了PAX6基因中的一个新的突变位点（c.796delG，p.A266fs）导致移码突变，编码同源结构域基因序列中出现提前终止密码子，导致脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸的结构域缺失。
　　2.实时荧光定量PCR发现，突变的PAX6基因转录产生的mRNA比正常人少近50%，与PAX6基因单倍剂量不足是先天性无虹膜的表型基础的理论相一致。
　　3.这个发现不仅扩增了PAX6基因的突变谱，进一步验证了PAX6基因在眼球发育过程中的重要作用，同时也对先天性无虹膜的分子生物学研究、基因咨询、产前诊断等提供参考。

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中英文缩略词表

引言

材料与方法

1.主要仪器、试剂与耗材

2.研究对象及方法

结果

1.家系成员的一般表现

2.PCR扩增产物比较

3.DNA测序分析结果

4.两个组PAX6基因实时荧光定量PCR检测比较

讨论

参考文献

综述: 先天性无虹膜

摘要

概述

1.临床表现

2.分子遗传学基础

3.临床治疗进展

展望

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢