BRL37344对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响及机制研究

摘要

目的：
　　 肥胖与目前高发疾病如糖尿病和心血管疾病密切相关。目前观点认为肥胖的原因不仅仅是脂肪组织的肥大，而且还有由前体脂肪干细胞分化为成熟脂肪细胞导致的脂肪组织增生。前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞是一个关键的过程，涉及特定基因和相关蛋白的协调表达。MEK/ERK信号通路是目前研究与脂肪细胞分化最为重要的信号通路之一。选择性β3肾上腺素能受体激动剂(beta3-adrenergic receptor agonist，β3-ARa)已被证明具有参与脂肪动员和产热作用。BRL37344是一种选择性β3肾上腺素能受体激动剂，在龋齿类动物相关研究中发现其具有促进脂肪分解和抗心律失常的作用，并且可以通过促进白色脂肪组织的脂肪分解及棕色脂肪组织的非战栗产热来促进能量释放，调控能量平衡，为抗肥胖药物的研究提供了新的选择角度。本研究旨在通过观察研究选择性β3肾上腺素能受体激动剂BRL37344对3T3-L1小鼠前体脂肪细胞分化的影响，进一步探讨BRL37344在前脂肪细胞分化中的作用机制。
　　 方法：
　　 本研究以3T3-L1小鼠前体脂肪细胞作为研究对象，分别应用BRL37344、MEK抑制剂PD98059、BRL37344+PD98059干预处理诱导分化的3T3-L1小鼠前脂肪细胞，以单独应用标准生脂培养液诱导分化的前体脂肪细胞为对照组，另设标准生脂培养液+0.1％ DMSO作为DMSO对照组以排查0.1％ DMSO对前体脂肪细胞的毒性作用，48 h后换用含有上述新鲜配制干预药物的维持分化液，于诱导分化的第5d应用油红O染色技术鉴定前体脂肪细胞分化程度，裂解细胞、收集蛋白-80℃冻存备用。为了进一步探讨BRL37344与胰岛素对ERK1/2信号通路早期刺激作用的异同，待前体脂肪细胞完全汇合24 h，并剥夺血清4h，分别用Insulin、BRL37344、Insulin+BRL37344、BRL37344+PD98059处理细胞60 min，分别于药物刺激的0 min、5 min、10 min、60 min裂解细胞、收集蛋白。
　　 通过Western blot蛋白印迹法测定pERK、tERK及脂肪细胞特异性分化转录因子(peroxisome proliferator-activated receptorγ2，PPARγ2)表达水平的变化。每组实验重复3次以上，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0统计学软件分析，两组均数比较采用独立样本t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.成功诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。
　　 2.BRL37344能够抑制前体脂肪细胞分化。
　　 3.3T3-L1前体脂肪细胞诱分化第5d，与对照组相比，BRL组及PD组PPARγ2表达明显下调36.07％和45.08％，差异有统计学意义(P＜0.05); DMSO组及PD+BRL组PPARγ2表达与对照组比较无明显差异(P＞0.05）;与对照组比较BRL组pERK1/2呈强性表达，是正常对照组的2.99倍(P＜0.05)，其余三组与对照组比较均无明显差异（P＞0.05）;对于tER蛋白表达，与对照组相比均无统计学差异(P＞0.05）。
　　 4.单独应用胰岛素处理前脂肪细胞60 min，pERK1/2表达迅速增加，高峰出现在第5 min，是作用0 min的1.60倍(P＜0.05);单独的BRL37344也促使ERK磷酸化，并且磷酸水平持续至少60 min，分别是0 min的1.60倍(P＜0.05)、1.46倍、1.69倍(P＜0.05);当用胰岛素及BRL37344同时处理细胞时，pERK1/2高水平表达并且持续时间长达60 min，分别是0 min的1.71倍(P＜0.05)、1.33倍、1.59倍(P＜0.05);ERK1/2上游激酶MEK特异性抑制剂PD98059可以抑制BRL37344诱发的ERK磷酸化，作用高峰出现在第5 min，是0 min的2.12倍(P＜0.05)，随后ERK的活化水平迅速下降。
　　 结论：
　　 1.成功建立3T3-L1前体脂肪细胞分化模型。
　　 2.BRL37344可以抑制3T3-L1前体脂肪细胞的分化。
　　 3.BRL37344可显著增强ERK1/2的活化效应，下调3T3-L1前脂肪细胞分化过程关键因子PPARγ2表达水平，这可能是其抑制前脂肪细胞分化及抗肥胖的作用机制。
　　 4.PD98059能够特异性阻断ERK1/2激酶MEK对ERK1/2的磷酸活化，部分改善BRL37344对PPARγ2表达的下调，逆转BRL37344对前体脂肪细胞分化的抑制作用，说明BRL37344是通过MEK/ERK信号通路对前体脂肪细胞分化起到抑制作用。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1．1 研究对象

1．2 实验试剂与耗材

1．3 实验仪器与设备

1．4 实验器皿及处理

1．5 药物及实验试剂的配置

1．6 实验方法

结果

2．1 3T3-L1脂肪细胞形态学观察及鉴定

2．2 诱分化第5d的3T3-L1前体脂肪细胞油红O染色

2．3 Western blot法检测相关蛋白

讨论

结论

参考文献

参加论文和科研情况说明

附录

综述 p44／42 MAPK信号通路与脂肪细胞分化

致谢