Pim-3在卵巢癌中的表达及其过表达对卵巢癌SKOV3细胞影响的实验研究

摘要

近年研究发现Pim-3可抑制凋亡，促进细胞增殖并影响细胞周期，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用，成为肿瘤研究中一个全新的热点，对Pim-3功能的深入研究将使目前对肿瘤发生发展调控网络的认识带来革命性的变化。Pim-3在肝癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤存在异常表达，并与肿瘤的的发生发展、转移潜能及术后复发有关。同是Pim家族的Pim-1在上皮性卵巢癌中高表达并发挥抗凋亡作用，但Pim-3在卵巢癌中的表达及其在卵巢癌发生、发展中的作用尚有待于进一步研究。
　　目的:
　　1.检测Pim-3基因在卵巢癌组织、良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织中的表达差异，探讨Pim-3表达量与卵巢癌临床病理因素之间的关系;
　　2.构建Pim-3过表达慢病毒真核表达载体，转导入人卵巢癌细胞株SKOV3中，筛选获得Pim-3过表达单克隆细胞株;
　　3.探讨过表达Pim-3后卵巢癌细胞SKOV3增殖、迁移及凋亡等生物学行为的改变。
　　方法:
　　1.Trizol法提取26例卵巢癌、25例卵巢良性肿瘤及16例正常卵巢组织标本的总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）方法，检测各标本组织中Pim-3的表达量，比较三组之间的表达差异，分析Pim-3基因的表达量与卵巢癌临床病理特征的关系。
　　2.采用RT-PCR方法，自人卵巢癌SKOV3细胞中提取总RNA，特异性扩增Pim-3片段，将扩增产物克隆至pMD19-T simple载体，双内切酶切下粘性末端，克隆至慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上，测序鉴定挑选构建成功的重组慢病毒真核表达载体;将阳性重组质粒及空白质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞，荧光显微镜下观察转染情况，选用单细胞有限稀释法筛选单克隆细胞株，应用实时荧光定量PCR及Western Blot法分别鉴定Pim-3mRNA及其蛋白水平的表达量。
　　3.建立过表达Pim-3的SKOV3卵巢癌细胞株后，应用CCK8法检测细胞增殖能力;划痕实验检测肿瘤细胞迁移能力;流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡。
　　结果:
　　1.Pim-3mRNA在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及卵巢癌组中的表达量分别为:2.88±4.57、0.065±0.040及0.028±0.015，Pim-3在卵巢癌组织中的表达量显著高于良性卵巢肿瘤组及正常卵巢组，差异均有统计学差异(P＜0.05)，良性肿瘤组与正常组之间无统计学差异(P＞0.05)。卵巢癌组织中的Pim-3基因表达量与年龄(P=0.53)、有无腹腔积液(P=0.07)无关(P＞0.05)，与临床分期(P=0.02)、病理分级(P=0.03)及有无转移(P=0.03)有关(P＜0.05)。
　　2.经pMD19-T simple载体和pCDH载体克隆、酶切鉴定及序列分析后，证实人Pim-3过表达重组慢病毒真核表达载体构建成功。感染pCHD-Pim-3重组质粒及pCDH空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞，在荧光显微下观察到带绿色荧光的SKOV3细胞，应用单细胞有限稀释法获得单克隆细胞株，实时荧光定量PCR及Western Blot鉴定显示感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞，Pim-3过表达细胞株建立成功。
　　3.经CCK8试剂盒检测24小时、48小时及72小时后重组质粒组OD450值分别为0.53±0.07、2.17±0.03及3.67±0.25，pCDH空质粒组分别为0.44±0.03，1.53±0.03及2.64±0.40，与空载体转染的SKOV3细胞相比，过表达Pim-3可促进SKOV3细胞增殖(P＜0.05);空白细胞组、空载体对照组及重组质粒组24小时细胞迁移距离分别为3.21±0.23mm、3.14±0.17mm、4.00±0.33mm，过表达Pim-3后细胞迁移能力增强(P＜0.05);流式细胞仪检测发现过表达Pim-3后SKOV3细胞的凋亡率较pCDH组及空白细胞组减少(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.Pim-3mRNA在卵巢癌组中的表达量高于卵巢良性肿瘤组及正常卵巢组，差异均有统计学差异，良性肿瘤组与正常组之间无统计学差异。卵巢癌组织中的Pim-3基因表达量与年龄、有无腹腔积液无关，与临床分期、病理分级及有无转移有关。
　　2.成功构建了人Pim-3过表达慢病毒真核表达载体pCDH-Pim-3，转染SKOV3细胞后，筛选获得Pim-3过表达的SKOV3卵巢癌单克隆细胞，Pim-3mRNA及蛋白表达水平均上调。
　　3.Pim-3过表达后卵巢癌细胞的增殖及迁移能力得到增强，并抑制了卵巢癌细胞的凋亡。为深入研究Pim-3在卵巢癌发生发展中的作用机制、寻找新的诊断治疗靶点提供了实验依据。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Pim-3在卵巢癌组织中的表达及临床意义

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象纳入标准

1．1．2 标本来源及病理资料

1．1．3 主要试剂及仪器

1．1．4 实验方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、pCDH-Pim-3慢病毒表达载体构建及Pim-3过表达SKOV3单克隆细胞株的建立

2．1 对象和方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 实验方法和流程

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

三、Pim-3过表达对SKOV3细胞的影响

3．1 Pim-3过表达对SKOV3细胞增殖的影响

3．1．1 对象和方法

3．1．2 结果

3．1．3 讨论

3．1．4 小结

3．2 Pim-3对SKOV3细胞迁移的影响

3．2．1 对象和方法

3．2．2 结果

3．2．3 讨论

3．2．4 小结

3．3 Pim-3对SKOV3细胞凋亡的影响

3．3．1 对象和方法

3．3．2 结果

3．3．3 讨论

3．3．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 LncRNAs在妇科肿瘤研究中的进展

致谢