血红素氧化酶1对脂肪间充质干细胞增殖、凋亡、成骨活性和募集能力的影响

摘要

目的：从大鼠腹股沟脂肪中提取培养脂肪基质干细胞（Adipose-derived stromal cells, ADSCs），鉴定其生物学特性；构建高表达血红素氧化酶1（Heme oxygenase1, HO-1）的慢病毒表达载体，包装病毒后转染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型；体外研究HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响，以及对周围细胞的募集作用，并探讨其在骨组织工程中的应用策略。
　　方法：1.胶原酶消化脂肪获取细胞后，采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养 ADSCs，接种于培养基中进行培养传代。通过观测其形态特点、流式细胞技术鉴定其表面标志和多功能分化潜能（成脂分化和成骨分化）鉴定培养细胞为脂肪基质干细胞；2.从携带有目的基因 HO-1的载体 Puc57上克隆目的基因序列，通过酶切、酶连，将其连入慢病毒表达载体pZsG中，再将连接成功的表达载体转化感受态大肠杆菌 DH5α，经菌落 PCR鉴定连接结果，扩增提取该表达载体。将携带目的基因的慢病毒表达载体与另外三个慢病毒包装载体在293T细胞中包装，分别于48h和72h收集慢病毒液。在8μg/ml的转染试剂Polybrene条件下转染ADSCs，建立ADSCs-HO-1模型，western blot验证转染结果；3.将细胞分为四组：ADSCs转导HO-1组（A组）、ADSCs转导空载体组（B组）、ADSCs未转导组（C组）和ADSCs转导HO-1组加锡-原卟啉(Sn-protoporphyrin, SnPP)（D组）。采用MTT、流式细胞仪分析凋亡率探讨HO-1修饰的ADSCs对其自身增值、凋亡和成骨分化的影响；通过qRT-PCR检测骨标志物和钙基质染色分析HO-1修饰的ADSCs对其自身成骨分化情况；划痕实验和transwell观察HO-1高表达对ADSCs募集作用的影响。
　　结果：1.体外成功分离培养出大鼠 ADSCs，形态呈长梭形，具有成骨、成脂分化潜能，经鉴定第2代贴壁细胞阳性表达CD29（99.3％）、CD44（70.7%）、CD90（52.0%），阴性表达CD45（3.73%）和CD31（6.58%）；
　　2.构建高表达HO-1的慢病毒表达载体pZsG-HO-1，菌落PCR证实HO-1片段连入表达载体，包装慢病毒后转染ADSCs，western blot检测HO-1蛋白在ADSCs中高表达；
　　3.①MTT连续1周检测A和B组细胞活性，第2天测定A组较B组活性增高，差异有统计学意义（p<0.05）且持续一周；②流式分析细胞凋亡率显示，A组细胞凋亡率为41.3%±3.34%，较B组（58.7%±4.25%）和C组（55.3%±4.50%）明显降低，差异有统计学意义（p<0.05），且SnPP可增加A组细胞的凋亡率（70.7%±4.01%）；③qRT-PCR测得细胞成骨分化第7天时， ALP和Runx2升高，差异有统计学意义（p<0.05），ColⅠ和OCN未见明显差异；第14天时， ALP、Runx2、ColⅠ和OCN均较第7天升高，差异有统计学意义（p<0.05）；第21天时，茜素红和von kossa均证实，HO-1高表达可提高ADSCs钙结节形成。④划痕实验显示A组细胞迁移率69.3%±3.8%，较B组（31.5%±8.4%）和C组（32.8%±8.6%）明显增加，差异有统计学意义（p<0.05）；transwell实验证实，A组上清可增加细胞迁移的数量，且这种效应可被HO-1活性抑制剂SnPP抑制。
　　结论：1.密度梯度离心联合贴壁方法简单、可以大量体外扩增 ADSCs，具有多向分化潜能，表达间充质干细胞表面标记物，无内皮细胞和白细胞混杂。2.成功构建高表达HO-1的慢病毒表达载体和ADSCs-HO-1模型。3.HO-1高表达在无HO-1活性抑制剂存在的前提下，可提高ADSCs增殖活性、抗凋亡能力、促进ADSCs成骨分化和提高ADSCs募集能力。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、 ADSCs体外获取、鉴定

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、 HO-1高表达载体构建、鉴定

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、 HO-1对ADSCs增殖、凋亡、成骨活性及募集的影响

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

综述: 血管化组织工程骨构建策略及存在问题的研究进展

致谢