生肌液对骨髓基质干细胞增殖、成骨活性和凋亡状态影响的研究

摘要

临床上由于骨折或其它原因引起的骨缺损很常见，且治疗困难，目前采用的自体骨和异体骨移植均有各自的不足之处，自体骨移植的骨量受到限制，另外也增加了病人的痛苦，而异体骨移植可能出现免疫排斥反应和其它的并发症。将组织工程化骨用于骨缺损的修复是临床治疗的趋势所在，即从病人体内取少量的种子细胞，经体外诱导及培养，使其在短时间内大量增殖，再复合以支架材料，植入病人的骨缺损处，以达到治疗的目的，其中对种子细胞进行诱导和快速增殖的刺激因素是研究的重点之一，本实验旨在研究中药生肌液对骨髓基质干细胞(MarrowStromaCells，MSCs)功能状态的影响。 目的：观察中药生肌液对MSCs增殖、分化和凋亡的影响，筛选有利于MSCs高效增殖、定向成骨分化并能抑制其凋亡状态的相关因素，从而为研制一种来源相对丰富、组织相容性好和成骨能力强的组织工程骨创造条件。 方法：1.取成年家兔胫骨骨髓，用密度梯度离心—贴壁筛选的方法，获取MSCs并进行培养和鉴定。2.分别采用水煎法和微波法提取全方生肌液和去当归生肌液，利用细胞形态学观察和MTT检测的方法筛选最佳制备方法和组方生肌液。3.采用不同组方生肌液，利用空白对照、标准对照、阴性对照等比对方法，观察生肌液对MSCs增殖的影响。4.通过形态学观察和检测细胞分泌碱性磷酸酶和骨钙素的方法，比较不同组方生肌液对MSCs成骨活性的影响。5.利用形态学观测、荧光显微分析和流式细胞分析的方法，考察生肌液对MSCs凋亡状态的影响。 结果：1.采用密度梯度离心—贴壁筛选的方法，获取家兔骨髓中的MSCs，培养第3天，大部分细胞已经贴壁生长，至第10天时细胞已融合成片，呈指纹状排列，传代后增殖能力旺盛。2.MTT结果显示全方生肌液水煎提取法和微波法提取法均以4mg/ml组优于其它浓度生肌液组，也优于原方法提取生肌液组和普通培养液组。去当归生肌液水煎提取法的MTT值明显高于微波法提取法。3.MTT检测结果显示，不同组方生肌液培养处于凋亡状态的MSCs，在24小时时间点，含血清培养液配制的全方生肌液和去当归生肌液高于去当归及生地生肌液，而在48小时时间点差别不明显。4.生肌液对处于不同增殖状态的MSCs分泌碱性磷酸酶、骨钙素的作用不同，其中经过凋亡诱导的MSCs在48小时时间点的值高于未经凋亡诱导MSCs，生肌液组间无统计学差别。5.与对照组相比，生肌液培养的MSCs处于凋亡状态的量较少，并且大部分处于早期凋亡状态，生肌液组间无统计学差别。 结论：1.从成年家兔骨髓中所获得的MSCs，具有分离容易、贴壁迅速、增殖速度快的特点，经过多次传代培养后，细胞仍具有较强的分裂增殖能力，是理想的骨组织工程种子细胞。2.实验发现，全方生肌液的水煎提取法和微波提取法，其最佳浓度均在4mg/ml附近，二者对于MSCs的增殖作用无差异；去当归生肌液的水煎法提取法明显优于微波法提取法。3.对于处于凋亡状态的MSCs，全方生肌液与去当归生肌液均有明显促进MSCs增殖的作用，而去当归及生地生肌液则对此无明显作用，表明在促进MSCs增殖方面，当归和生地在组方药中的作用是不同的，生地在这方面的作用更突出。4.生肌液在促进MSCs分化方面的作用是肯定的，在一定的细胞凋亡的基础上，其促进细胞分化的作用要优于处于细胞增殖旺盛的细胞，这种作用有明显的量效性和时效性。5.生肌液能明显抑制MSCs的凋亡状态，其抑制作用并不完全依赖于血清的存在，但血清的存在促进了其抑制细胞凋亡作用，生肌液组间在抑制细胞凋亡作用方面并没有显著性差异。

目录

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缩略语表

摘要

前言

主要试剂

主要试验器材及相关仪器

第一章MSCs的获取和培养

第二章生肌液的制备

第三章生肌液对MSCs增殖的影响

第四章生肌液对MSCs成骨活性的影响

第五章生肌液对MSCs凋亡的影响

全文主要结论

参考文献

致谢

细胞凋亡机制研究进展