帕唑帕尼影响肺癌表达谱和miRNA谱的联合分析和代谢研究

摘要

目的： 肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，死亡率无论在中国还是世界范围内均排恶性肿瘤的第一位,且仍呈上升趋势。在肿瘤的发生发展过程中，大多会表现一系列共有的特征，包括：持续性的增值信号、逃逸生长抑制因子、抵抗细胞死亡及永生化、激活侵袭转移和促进血管生成。针对肿瘤的血管生成，目前已经开发有针对VEGF及其受体的单克隆抗体还有帕唑帕尼等受体酪氨酸激酶抑制剂等。临床前研究确认帕唑帕尼等酪氨酸酶抑制剂具有明确的抑制肿瘤增殖、内皮细胞成管和抑制移植瘤增殖的作用，但临床研究发现其总体生存期等指标较对照组提升不明显，尚需对帕唑帕尼等抑制剂的作用机制和细胞耐受反应进行深入的研究。 方法： (1)本研究选择多种非小细胞肺癌细胞系A549、H460、L9981和YTMLC-90作为实验对象。 (2)应用MTT法探究帕唑帕尼对个细胞株合适的干预剂量范围和时间。 (3)利用流式细胞术、划痕实验、transwell侵袭实验探究帕唑帕尼对肺癌细胞周期分布、迁移及侵袭能力的影响。 (4)提取10μM帕唑帕尼干预组和溶剂对照组帕唑帕尼的总RNA进行表达谱和miRNA谱的芯片检测，筛选出各细胞株之间变化趋势相同的差异表达基因及miRNA。 (5)应用realtime PCR筛选和验证芯片结果；利用western Blot验证帕唑帕尼能上调PCK2表达水平。 (6)构建PCK2-pEGFP过表达质粒并通过Western blot验证其过表达效果。 (7)设计以PCK2为靶点的siRNAs，并通过realtime PCR鉴定其干扰效率。 (8)通过siRNAs和过表达质粒下调、上调PCK2水平，流式细胞术检测PCK2与细胞周期间的关系。 (9)通过siRNAs下调PCK2水平和帕唑帕尼诱导PCK2上调研究培养环境中葡萄糖和乳酸的动态变化。 (10)通过过表达质粒上调PCK2研究其与帕唑帕尼抑制肺癌增殖的关系。 结果： (1)MTT方法检测帕唑帕尼对A549、H460、L9981和YTMLC-90细胞在48小时的IC50分别为15.913±2.57μM、36.161±4.53μM、9.81±1.34μM和11.448±3.28μM；在96小时的IC50分别为11.693±0.79μM、13.472±1.3μM、5.395±1.38μM、7.001±3.33μM。 (2)流式细胞术显示帕唑帕尼在0-10μM范围内呈剂量依赖性增加A549、H460和L9981细胞G0/G1期的比例。 (3)划痕实验显示帕唑帕尼聚能你抑制A549和L9981细胞的迁移能力，但对H460、YTMLC-90细胞迁移能力影响不显著。 (4)Transwell侵袭实验发现帕唑帕尼能增强四株细胞的侵袭能力。 (5)表达谱芯片发现在帕唑帕尼作用下，四株细胞DDIT3、ANKRD29、ARL8A、PCK2和TRIB3转录水平一致上调，而KIAA1429及hsa-miR-1233-5p、has-miR-1307-5p转录一致下调。 (6)Realtime结果证实帕唑帕尼在四株细胞内均引起PCK2、DDIT3和CHAC1的转录水平上调和has-miR-1233-5p的下调。 (7)构建的PCK2-pEGFP过表达质粒在转染L9981细胞后，Western Blot检测发现过表达组较对照组表达水平升高。 (8)realitme PCR证实siPCK2-806、siPCK2-1363对PCK2的干扰效果佳，在A549、L9981细胞内mRNA水平均能下降至对照组的0.3倍以下。 (9)流式细胞术示过表达PCK2能提高A549细胞在普通培养环境和低糖环境下的S期比例，相反下调PCK2水平则降低A549在两种培养环境中S期的比例。 (10)细胞生长曲线示过表达PCK2则A549生长曲线上抬，细胞增殖速度增快；下调PCK2则生长曲线下移，细胞增殖速度减慢。 (11)转染siPCK2下调PCK2表达，A549培养环境中糖异生峰降低，而乳酸生成水平增高；利用帕唑帕尼诱导PCK2表达则糖异生峰升高，乳酸生成水平下降。 (12)在A549过表达PCK2，帕唑帕尼的IC25上升3.56倍，达12.11μM。 结论： (1)帕唑帕尼能直接抑制多种非小细胞肺癌的增殖，诱导部分细胞株的G/S期阻滞并降低其迁移能力，但普遍促进多种细胞株的侵袭能力。 (2)帕唑帕尼能够上调PCK2基因表达。 (3)上调的PCK2能够促进肺癌细胞糖异生，提高细胞S期比例，并降低帕唑帕尼对其的抑制能力。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、帕唑帕尼对肺癌增殖和转移能力的体外研究

1.1实验材料

1.1.1细胞株

1.1.2 主要试剂和材料

1.1.3主要仪器

1.1.4试剂配制

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

1.2.2 MTT检测帕唑帕尼对A549，H460，L9981和YTMLC-90的抑制作用。

1.2.3 细胞生长曲线的测定

1.2.4 细胞周期的测定

1.2.5 细胞迁移能力检测

1.2.6 Transwell侵袭实验

1.3 结果

1.3.1 A549、H460、L9981和YTMLC-90生长曲线和倍增时间

1.3.2 药物抑制率

1.3.3 pazopanib对周期的影响

1.3.4 pazopanib对细胞迁移能力的影响

1.3.5 pazopanib对细胞侵袭能力的影响

1.4 讨论

1.4.1 帕唑帕尼的理化性质

1.4.2 帕唑帕尼对各细胞株存活率的抑制实验

1.4.3 帕唑帕尼对细胞迁移能力的影响

1.4.4 帕唑帕尼对侵袭能力的影响

1.4.5 帕唑帕尼对非小细胞肺癌周期的影响

1.5 小结

二、帕唑帕尼作用于多种非小细胞肺癌的表达谱和miRNA谱改变的检测和验证

2.1实验材料

2.1.1 细胞株

2.1.2 主要试剂盒材料

2.1.3 主要仪器

2.1.4 试剂配制

2.2 实验方法

2.2.1 细胞收集和总RNA制备

2.2.2 RNA定量和质检

2.2.3芯片杂交

2.2.4 芯片洗涤

2.2.5 芯片扫描及数据采集

2.2.6 芯片数据处理和分析

2.2.7 实时定量引物设计

2.2.8 Realtime PCR

2.3 实验结果

2.3.1用于miRNA芯片的RNA质检

2.3.2 miRNA 芯片结果

2.3.3.差异表达miRNA-mRNA关系及网络图

2.3.4 差异表达基因的realtime PCR验证

2.3.5 差异表达miRNA的realtime PCR验证

2.4 讨论

2.5 结论

三、糖代谢相关基因PCK2的验证和功能的初步研究

3.1 实验材料

3.1.1细胞株

3.1.2主要试剂和材料

3.1.3 主要仪器

3.1.4试剂配置

3.2实验方法

3.2.1 PCK2过表达载体的构建

3.2.2 RNA oligo序列和订购

3.2.3质粒及oligo转染

3.2.4 Realtime PCR检测PCK2 siRNAs干扰效率

3.2.5 Western Blot检测PCK2过表达载体及PCK2 siRNAs在蛋白水平对PCK

3.2.6 转染PCK2 siRNAs及过表达质粒对细胞增殖的影响

3.2.7 PCK2基因对细胞周期水平的影响

3.2.8 PCK2基因对低糖高乳酸环境下细胞葡萄糖消耗及乳酸生成水平的影响

3.3 实验结果

3.3.1 realtime PCR验证 PCK2 siRNA干扰效果，探究 miR-1233-5p

3.3.2 Western Blot 检测帕唑帕尼对PCK2的诱导作用，及验证PCK2-pEGFP过

3.3.3 转染PCK2 siRNAs及过表达质粒对周期的影响。

3.3.4 转染PCK2 siRNAs或帕唑帕尼干预对A549在条件培养环境下葡萄糖的消耗和乳酸生成

3.3.5转染PCK2 siRNAs及过表达质粒对细胞增殖的影响

3.3.6 转染 PCK2过表达质粒对帕唑帕尼药物抑制率的影响

3.4 讨论

3.4.1改变PCK2表达水平对培养环境中乳酸和葡萄糖的影响

3.4.2 改变PCK2表达水平对细胞增殖能力的影响

3.4.3改变PCK2表达水平对帕唑帕尼对A549抑制能力的影响

3.5小结

四、PTEN对多种抗肿瘤药物的单药和联合作用的影响

4.1 实验材料

4.1.2 主要试剂和材料

4.1.3 主要仪器

3.1.4主要试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1接种细胞

4.2.2稀释药物

4.2.3加5mg/ml MTT溶液并酶标仪上机检测

4.2.4计算细胞抑制率和联合干预的相关参数

4.3 结果

4.3.1 单药作用48小时对成组细胞株：MEF WT、MEF PTEN -/-，HCT116 WT

4.3.2 双药物联合对作用48小时对成组细胞株：MEF WT、MEF PTEN -/-，HCT11

4.4 讨论

4.5 小结

全文结论

论文创新点

发表论文和参加科研情况说明

附录

参考文献

综述

致谢