定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学鉴定Rictor在调节细胞粘附中的作用

摘要

目的：哺乳动物雷帕霉素靶标复合体2(The mammalian target of rapamycin complex2,mTORC2），在多种生物进程中发挥着重要作用，如调节RhoGTp酶的活性、调节肌动蛋白骨架的重建、促进血清诱导的张力纤维或F型肌动蛋白的形成、调节体内多种蛋白的磷酸化等。Rictor（Rapamycin insensitive companion of mTOR,Rictor）是mTORC2的一个特异性亚基，接受细胞信号刺激后可以调节细胞的生长和生存。为了更好的研究mTORC2的功能以及潜在的分子机制，我们建立了一个Rictor降表达的稳定细胞系，用以研究Rictor降表达后细胞蛋白质组和磷酸化蛋白组的变化，从而对mTORC2的功能以及潜在的机制进行阐述。 方法：首先，用含有Rictor降表达序列的慢病毒转染HEK-293T细胞并进行病毒的扩增，将扩增后的病毒转染到人肾癌细胞ACHN内并进行筛选，从而建立Rictor降表达的稳定细胞系。然后利用8M尿素进行细胞全蛋白的萃取，并对蛋白进行还原和烷基化，再采用超滤管辅助样本制备（Filter aided proteome preparation,FASP）的方式对提取的蛋白进行酶解。酶解后的大部分肽段用TiO2磁珠进行磷酸化的富集。剩余小部分酶切肽段进行TMT的标记，以实现定量蛋白质组学分析。TMT标记后的肽段等比例混合，利用高pH反向分馏色谱柱对标记肽段进行分馏。将分馏后的肽段和磷酸化富集的肽段进行液相串联质谱的检测。最后再利用Proteome Discoverer（PD）分析软件对质谱数据进行解析和定量，从而筛选出差异蛋白。 结果：对于TMT标记的全蛋白样本共鉴定到5096个蛋白，去除199个肽段数为1的蛋白和33个无定量值的蛋白，剩余4864个可定量的蛋白。其中P值小于0.05的蛋白有2175个，变化倍数大于1.5倍的蛋白有151个，包括101个表达降低的蛋白和50个表达升高的蛋白。对于磷酸化富集的样本，共鉴定到77个差异蛋白和111条差异表达的磷酸化肽段，其中69个差异蛋白，对应98条差异肽段是降表达的；8个差异蛋白，对应13条差异肽段表达量出现了上调。 结论：联合蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学的定量分析，表明Rictor/mTORC2与细胞的多个进程密切相关，尤其是细胞粘附，鉴定到多个差异蛋白如JUP，CD9，LAMB2等。此外，实验结果显示Rictor降表达后细胞内磷酸化水平下降的蛋白与细胞紧密连接有关，其中紧密连接蛋白2（tight junction protein2,TJP2）的（Ser979,Ser986,Tyr115）位点下调。TJP2是紧密连接的一个重要组分。进一步的实验也表明Rictor/mTORC2通过TJP2调节紧密连接的功能。综上所述，该研究较全面的揭示了Rictor/mTORC2调节的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，结果提示Rictor/mTORC2通过调节细胞间相互作用，调节肾癌细胞的迁移和侵袭。

目录

第一个书签之前