集胞藻PCC6803合成三羟基丙酸(3-HP)的优化

摘要

随着化石能源的加速消耗和环境污染的日益加重，光合蓝细菌作为“微生物细胞工厂”来实现生物燃料及化学品的合成和生产已引起研究者的广泛关注。集胞藻PCC6803作为光合蓝细菌的模式微生物，具有巨大的生物工程应用潜力。本研究主要是对集胞藻PCC6803中构建的三羟基丙酸生物合成途径进行优化。
　　3-HP作为一种重要的平台化合物具有重大的经济开发价值，近些年来对3-HP生物合成的研究越来越多。本实验室在前期的工作中已首次成功实现在集胞藻PCC6803中构建3-HP的生物合成途径，并进行了一系列优化措施提高了3-HP的产量，然而，3-HP的产量还是很低。本研究主要在前期工作的基础上，进一步发掘能够提高集胞藻PCC6803中3-HP产量的方法和策略，主要包括以下几个方面：1）分别过表达碳酸氢根转运蛋白BicA（Sll0834）和SbtA（Slr1512），以提高碳源转运效率；2）过表达编码 NAD(P)H氧化还原蛋白的基因 flv3（sll0550），以提高光合作用及ATP供应；3）敲除天线蛋白Slr0335，截短光捕获天线复合体，减少光能损伤，从而提高光合效率；4）敲除糖原代谢途径，以便于更多的碳源流向目标产物；5）增强启动子强度提高乙酰辅酶A羧化酶基因（acc）的表达量，以增加前体物质的供应。此外，由于蓝细菌固有的固碳效率相对较低，因此在底盘水平上增强宿主细胞的固碳能力对于优化蓝细菌生产生物燃料和化学品具有重要意义。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是光合碳同化的限速酶，但其活性很低从而限制着蓝细菌底盘的固碳效率。因此，我们还在集胞藻PCC6803野生株中分别过表达3个来源不同的RubisCO，以期望提高底盘细胞的固碳效率和生长速率，从而应用于优化3-HP的生物合成。
　　最终研究结果表明，通过过表达同源碳酸氢根转运蛋白 BicA（Sll0834）和NAD(P)H氧化还原蛋白的基因flv3，使得3-HP的产量分别提高了26％和10%，而上述其他策略对3-HP产量的影响并不明显，这表明它们也许并不是影响3-HP生物合成的主要因素。此外，过表达3个蓝细菌来源的RubisCO并没有对集胞藻PCC6803的生长速率产生明显影响，也没有提高宿主细胞3-HP的产量。这些结果表明增强集胞藻 PCC6803的碳酸氢根摄取能力及能量供应对于提高3-HP的产量有明显作用。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 蓝细菌简介

1.2 蓝细菌微生物细胞工厂

1.2.1 蓝细菌细胞工厂的优势

1.2.2 蓝细菌细胞工厂的研究进展

1.2.3 蓝细菌细胞工厂的问题

1.3 三羟基丙酸（3-HP）的研究概述

1.3.1 三羟基丙酸的理化性质及应用

1.3.2 三羟基丙酸的合成

1.3.3 蓝细菌合成三羟基丙酸的研究

1.4 RubisCO的研究概述

1.4.1 RubisCO的简介

1.4.2 RubisCO的研究现状

1.5 本研究的内容和意义

第二章 集胞藻PCC 6803合成三羟基丙酸（3-HP）的优化

2.1 实验材料

2.1.1 实验对象及来源

2.1.2 实验仪器与设备

2.1.3 实验培养基与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 实验设计思路

2.2.2 过表达突变株的构建

2.2.3 敲除突变株的构建

2.2.4 突变株的培养方法

2.2.5 3-HP产量的检测方法

2.2.6 基因表达水平的RT-qPCR分析

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 3-HP生产菌株的构建及验证

2.3.2 碳源转运蛋白的过表达

2.3.3 直接前体物质含量的优化

2.3.4 系统内能量供给的优化

2.3.5 糖原代谢途径的敲除

2.4 本章小结

第三章 集胞藻PCC 6803中过表达RubisCO优化固碳效率

3.1 实验材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 实验结果与讨论

3.2.1 过表达菌株的构建及验证

3.2.2 不同碳源浓度下的比较生长分析

3.2.3 过表达RubisCO对3-HP产量的影响

3.3 本章小结

第四章 结论与展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢