乳酸乳球菌F44中耐酸相关sRNA s015的鉴定及相关性能的研究

摘要

乳酸乳球菌是一种工业上常用的益生菌，其分泌产物是对人体无害的防腐剂Nisin，但是乳酸菌无论在自然环境中还是在发酵液中，随着其生长乳酸乳球菌将面临各种环境胁迫，尤其是菌体代谢产物使发酵液pH降低而形成不利的生长环境的矛盾。然而，低pH值环境下nisin的稳定性更高，因此菌株耐酸性能的提升可以间接提高nisin的产量。在乳酸菌的多种调控机制中，非编码小RNA是一种重要的调控因子。非编码小RNA (sRNA)在上级调控因子的信号的刺激下开始转录，转录产物并不与核糖体结合翻译成蛋白质，而是作为一段游离的RNA通过与相应的靶标mRNA结合的来影响靶标的翻译进程，从而达到相应的调控作用。 本实验室基于RNA-sequencing分析，qRT-PCR筛选得到一系列候选sRNA，本研究基于northern blot杂交鉴定出乳酸乳球菌F44中的新sRNA：s015。s015可以提高菌株的耐酸性，且有益于低pH下的nisin的产量。 通过三种靶标预测软件进行生物信息学预测，得到了 sRNA s015 的靶标基因库。对候选靶标进行统计分析，绘制韦恩图；对sRNA的结合位点进行统计学分析，得出结合位点分布概率图，从中挑选合适的靶标进行验证，验证得到atpG, busAB, cysD, ilvB, yudD, ywdA 是sRNA s015的抑制靶标基因，tcsR, ung为sRNA s015的激活靶标基因。 基于 s015 的保守性以及预测得到的靶标基因与 s015 结合位点集中于 s015的特定保守区段(5’-GAAAAAAAC-3’)，突变保守区域进行验证，证实该保守区是 s015 的调控核心区。通过对过表达靶标基因的菌株进行耐酸性检测和发酵实验，发现靶标基因atpG、busAB、ung和ilvB是酸刺激条件下耐受性相关的下游基因，ywdA可能是s015协同调控的下游基因。

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