乳酸乳球菌F44耐酸相关sRNA c277功能研究及高产菌株构建

摘要

细菌非编码小RNA（sRNA）在菌体的应激反应中起重要作用，但很少有研究探讨sRNA在乳酸乳球菌中的功能。本课题组之前的研究表明，在pH5.0条件下将菌株应激之后，RNA深度测序和验证发现19个sRNA在酸性条件下高表达，其调控机制有待深入研究。 经过筛选，我们确定了一个新的sRNA c277，其在酸胁迫条件下高表达，并利用Northern blot和qRT-PCR实验进行了验证。进一步通过快速扩增cDNA末端（RACE）实验确定了c277的全长为317nt。并构建c277敲除和过表达菌株进行耐酸实验，与野生型乳酸乳球菌F44相比，c277过表达菌株的存活能力降低，c277缺失菌株的存活力增强。 为了进一步探索c277的调控机制，对敲除菌株与野生型菌株进行了蛋白质组学对比分析，一系列氨基酸转运及代谢基因和转录调控因子等受到c277的影响。同时用生物信息学方法预测了c277潜在的靶标基因，结合蛋白组学和软件预测结果，选取6个靶标进行荧光蛋白融合和点突变实验证实。结果显示，c277存在一个潜在保守区（GCCTTTC），可直接与靶标核糖体结合位点进行碱基互补配对抑制三种氨酰tRNA合成酶，Alas，Thrs和Tyrs，和一种转录调节因子YthA的表达。此外，我们课题组之前发现YthA增加了几种氨基酸合成途径，特别是精氨酸，因此间接证明c277可能通过YthA影响精氨酸合成。总体而言，本研究模拟了c277的潜在调控网络，揭示了酸应激反应的调节机制。 另外，构建了人工sRNA文库，从中筛选出了能够抑制glnR表达的人工sRNA。构建过表达菌株，其表现出优于野生型的耐酸性，并且有效的提高了菌株的nisin产量，为构建高产菌株提供了新的思路。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1引言

1.2乳酸链球菌素Nisin的功能及应用

1.3乳酸乳球菌及其耐酸机理研究进展

1.4非编码小RNA的作用方式

1.4.1核糖开关

1.4.2模拟核酸结构sRNA

1.4.3顺式编码sRNA

1.4.4反式编码sRNA

1.4.5双重功能sRNA

1.4.6耐酸相关sRNA举例

1.4.7乳酸乳球菌中sRNA实验基础

1.5人造sRNA的研究进展

1.6本论文的研究内容

第2章 耐酸相关sRNA c277的鉴定

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1实验质粒、菌株及培养基

2.2.2实验所用药品和试剂

2.2.3实验仪器和设备

2.3实验方法

2.3.1质粒的提取

2.3.2乳酸乳球菌基因组提取与目的基因扩增

2.3.3目的片段与载体的酶切及连接

2.3.4大肠杆菌 TG1感受态细胞的制备

2.3.5化学法转化感受态细胞

2.3.6转化子的筛选与验证

2.3.7 RNA提取实验

2.3.8 Northern blot印记杂交实验

2.3.9 RACE实验

2.3.10乳酸乳球菌F44感受态细胞的制备

2.3.11电转化乳酸菌感受态细胞及转化子的筛选与验证

2.3.12 sRNA c277的敲除与过表达菌株构建

2.3.13酸耐受实验

2.3.14乳酸菌发酵实验的测定

2.3.15 nisin效价的检测

2.4实验结果与分析

2.4.1sRNA c277在不同pH条件下的Northernblot实验

2.4.2 RACE以及sRNA c277敲除实验

2.4.3sRNA c277对于乳酸菌F44耐酸性的影响

2.4.4 c277对于乳酸乳球菌F44生长情况的影响

2.4.5乳酸乳球菌F44、F44-Δ277和F44-p277发酵产酸情况分析

2.4.6乳酸乳球菌F44、F44-Δ277和F44-p277生产nisin情况比较

2.5小结

第3章 sRNA c277的蛋白组分析及靶标预测

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.3.1蛋白组检测

3.3.2靶标预测

3.3.3靶基因筛选

3.4实验结果与分析

3.4.1蛋白组结果

3.4.2靶标预测结果

3.4.3潜在靶基因初步筛选

3.5小结

第4章sRNA c277靶标的验证与分析

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1实验试剂与培养基

4.2.2实验药品和试剂

4.2.3实验仪器和设备

4.3实验方法

4.3.1大肠杆菌 BL21感受态细胞的制备

4.3.2 RNA-RNA相互作用结合区域预测

4.3.3连有eGfp蛋白基因的靶基因低拷贝质粒的获得

4.3.4连有sRNA及突变sRNA的高拷贝质粒的获得

4.3.5大肠杆菌双质粒系统构建

4.3.6靶标验证实验菌株的荧光强度测定

4.4实验结果与分析

4.4.1靶标验证实验中融合蛋白荧光值结果

4.4.2 c277点突变实验的eGfp靶标验证结果

4.4.3综合结果简要分析c277对于乳酸乳球菌产生的影响

4.5小结

第5章 人工sRNA构建高产nisin菌株

5.1引言

5.2实验材料

5.3实验方法

5.3.1人造sRNA库的构建及eGfp融合蛋白实验进行筛选

5.3.2RNA的提取、Northern blot和qRT-PCR实验

5.3.3过表达菌株构建及酸耐受检测

5.3.4生长曲线、发酵液pH及nisin效价的测定

5.4实验结果与分析

5.4.1人造sRNA的筛选

5.4.2过表达人工sRNA生存及产酸能力分析

5.4.3过表达人造sRNA对nisin效价的影响

5.5小结

第6章 结论与展望

6.1结论

（1）Northern blot 验证c277的表达，RACE实验测定 c277全长

（2）sRNA c277对于乳酸菌的耐酸性、生长情况和 nisin 效价的影响

（3）sRNA c277对乳酸菌F44靶标的预测与验证

（4）c277对于靶标基因功能分析

（5）人造 sRNA anti41的筛选以及对乳酸菌的影响

6.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢