哺乳动物内质网体中FKBP23与BiP结合特异性的研究

摘要

该课题采用亲和吸附法结合免疫印迹(Immunoblot,即Western Blot)的检测方法,首次证明了在哺乳动物细胞内质网体中的两种高度保守的蛋白质FKBP23与BiP可以特异性地结合.通过氨基酸序列分析,我们分段克隆了mFKBP23的N端和C端蛋白,并通过上述的实验方法证明了只有mFKBP23的C端具有与BiP特异性结合的特征,而N端没有此特征.依据mFKBP23 C端的EF手模体结构具有Ca<'2+>结合活性的特征,我们通过改变结合缓冲液中Ca<'2+>浓度的实验证明了钙离子强度在FKBP23与BiP的结合中起调节作用,而且实验结果表明产生此调节作用的Ca<'2+>浓度的突变点应在2~3mM之间.为了更加具体地确定FKBP23与BiP的结合位点,我们初步探索了mFKBP23的N端和C端与mBiP的N端和C端之间交叉结合的情况.虽然目前没有确定的结论,但有结果表明这两个蛋白的N端及它们的C端之间分别可以特异地结合,此结果仍需进一步实验的证实.

目录

文摘

英文文摘

名词缩写解释

第一章前言

§1亲免蛋白研究概况

1.1亲免蛋白(Immunophilin)家族

1.2亲免蛋白的下游效应分子

§2蛋白质折叠与分子伴侣

2.1蛋白质折叠

2.2分子伴侣与热激蛋白

§3本课题提出的指导思想

第二章实验部分

§1试剂及仪器

1.1试剂

1.2仪器

§2缓冲液及贮存液

2.1分子克隆

2.2琼脂糖凝胶电泳

2.3细菌培养

2.4融合蛋白的表达及提取

2.5变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.6凝血因子Xa对融合蛋白的裂解

2.7白细胞内质网体的提取

2.8蛋白结合实验

2.9免疫印迹(Immunoblot，Western Blot)

§3实验方法

3.1目的基因的克隆

3.2目的蛋白的诱导表达及提纯

3.3多克隆免疫血清的制备

3.4白细胞内质网体的提取

3.5蛋白结合实验

3.6免疫印迹(Immunoblot，即Western Blot)

3.7其他常规实验方法

第三章实验结果与讨论

§1实验所需目的蛋白的制备

1.1用PCR扩增目的基因序列

1.2目的基因克隆的制备

1.3目的蛋白的提取

§2 MFKBP23序列结构特征分析

§3哺乳动物中FKBP23与BIP的同源性分析

§4白细胞ER中BIP的检测

§5蛋白结合实验

5.1克隆的FKBP23与ER的结合

5.2 FKBP23n、FKBP23c分别与ER的结合

5.3克隆的FKBP23和BiP的相互结合

5.4 FKBP23n、FKBP23c与BiP、BiPn及BiPc的交叉结合

5.5不同Ca2+浓度对FKBP23c与BiP结合的影响

§6实验进一步研究的方向

第四章总结

参考文献

研究生期间参与其他课题研究的情况

致谢

附录