哺乳动物内质网体中FKBP23与BiP结合行为的研究

摘要

FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)是免疫抑制剂FK506(Tacrolimus)在生物体内的天然配体，与另两类免疫抑制剂Cyclosporin A体内的配体亲环素(cyclophiIin CyP)和Rapamycin共同称为亲免素或亲免蛋白(Immunophilin)。亲免蛋白具有两大主要特征：一是遗传上的保守性，二是肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性。FKBP23是1998年在小鼠内质网(endoplasmicretictdum，ER)中发现的一个FKBP家族的蛋白质。它由一个N端的肽脯氨酰顺反异构酶结构域和一个C端的含有钙离子结合模体的结构域组成。BiP是Hsp70家族在内质网体中的成员。在生命体中，蛋白质在其生理位置需折叠成具有正常生理功能的空间结构才具有活性。Hsp70家族蛋白在生物体内的主要功能是在蛋白质于细胞内亚细胞结构间转运的过程及其折叠过程中，充当分子伴侣的角色。 我们曾利用免疫沉淀的方法证明小鼠内质网体中FKBP23与BiP特异性结合，并受Ca<'2+>浓度影响。在本实验中我们通过sephadex G-75凝胶色谱法进一步验证了不论是克隆的还是天然ER中的FKBP23和BiP都有这种受Ca<'2+>浓度影响的特异性结合行为，同时，通过GFC柱行为，从复合物对应的分子量我们可以知道，在体内和体外，FKBP23和BiP都是1：1结合，即一分子FKBP23和一分子BiP结合的，这是亲和吸附和免疫沉淀方法所无法得知的。 pFKBP23的序列目前在NCBI中没有公布。我们通过其他物种同源性分析、cDNA双链的合成，nest-PCR等方法得到了pFKBP23的序列。同时，由得到的序列可以看出，所得的pFKBP23的序列没有从TAG开始，所以序列并不完全，因此还要继续重复以找到序列最前端。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第一节亲免蛋白研究概况

1.1.1亲免蛋白家族

1.1.2亲免蛋白的下游效应分子

1.1.3分子伴侣与热激蛋白

第二节nested -PCR

1.2.1 PCR原理

1.2.2 nested PCR

1.2.3用于nest-PCR双链cDNA构建原理

第三节本课题提出的指导思想

1.3.1验证FKBP23与BiP在体内和休外的结合行为

1.3.2 pFKBP23克隆

第二章实验部分

第一节试剂及仪器

2.1.1试剂

2.1.2仪器

第二节缓冲液及贮存液

2.2.1细菌培养

2.2.2融合蛋白的表达及提取

2.2.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.4凝血因子Xa对融合蛋白的裂解

2.2.5肝脏中内质网体的提取

2.2.6蛋白结合实验

2.2.7免疫印迹

2.2.8三氯乙酸法沉淀蛋白质

2.2.9银染法

2.2.10分子克隆

2.2.11琼脂糖凝胶电泳

第三节实验方法

2.3.1内质网体中FKBP23和BiP结合实验

2.3.2 pFKBP23的克隆

第三章实验结果与讨论

第一节内质网体中FKBP23和BiP结合实验

3.1.1实验所需目的蛋白的制备

3.1.2 mFKBP23序列结构特征分析

3.1.3猪肝脏ER中BiP与FKBP23的检测

3.1.4 SephadexG-75柱子标定结果

3.1.5克隆的mFKBP23与mBIP分别过柱子结果

3.1.6克隆的mFKBP23与mBIP结合的测定结果

3.1.7天然内质网体中的FKBP23与BIP结合的测定结果

第二节pFKBP23的克隆

3.2.1pFKBP23中间序列扩增

3.2.2 nested-PCR扩增3’端和5’端

第四章小结

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果