Bacillus megaterium NK13中可拆分获得(R)-ketoprofen酯酶基因的研究

摘要

手性药物的研究和制备已经成为当今世界制药领域的主要方向。2-芳基丙酸类药物是一类重要的非甾体抗炎药,利用微生物中酯酶/脂肪酶的立体选择性制备2-芳基丙酸类药物(如酮基布洛芬和萘普生)的单一对映体具有重要的应用价值。在筛选出的野生菌中,尽管许多能较快地转化手性药物的底物,但因最终不能获得光学纯产物而不能用于生产。
　　 本文以本实验室筛选出的一株具有一定不对称转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯生成(S)-酮基布洛芬能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料(在24h时转化率大约为40％,(S)-酮基布洛芬e.e.％最高仅为5.84％),探讨影响光学纯度产物的可能因为。通过提取NK13基因组DNA、Sau3AI部分酶切,回收750～6000 bp大小的DNA片段,与经BamHI酶切的pIJC18载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,构建了该菌株的基因文库。
　　 利用三丁酸甘油酯筛选平板从基因文库中筛选获得一株阳性转化子,并对该转化子质粒中插入的外源片段进行了测序。分析测序结果,发现:外源片段的长度为3581 bp,其中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,编码由246个氨基酸残基组成的蛋白,包括28个强碱性氨基酸残基(K,R),37个强酸性氨基酸残基(D,E),76个疏水性氨基酸残基(A,I,L,F,W,V),54个极性氨基酸残基(N,C,Q,S,T,Y),等电点(pI)为5.749,属偏酸性蛋白。该蛋白序列中含酯酶的GXSXG保守序列。又将741 bp的基因序列和其编码的蛋白序列与NCBI中已知基因序列和蛋白序列进行同源性比对,没有发现与基因同源的序列；分析NK13菌中的741.bp基因编码的蛋白质发现与已有的 Bacillus cereuscarboxylesterase R309803、Geobacillus sp.G11MC16thermostable carboxylesteraseEst30等6种酶的同源性最高,仅为82％。说明该基因是一个新的酯酶基因,已提交GenBank,登录号为GU143552。经过设计引物、PCR扩增酯酶基因,连入pET-21b(+)载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建了该酯酶基因的表达重组菌。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa左右。利用乙酸对硝基苯酯法测定该酯酶粗酶液的酶活力,结果显示其酶比活力为0.35U/mg,比NK13粗酶液高70倍。
　　 用薄层层析和高效液相色谱对表达重组菌转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯的能力进行检测,结果显示:
　　 重组菌发酵液转化组在0.5 h时能转化15％左右的外消旋酮基布洛芬氯乙酯,此时生成(R)-酮基布洛芬的e.e.％最高,达62.74％；1 h时转化率达到30％,(R)-酮基布洛芬e.e.％仍保持在较高的60.78％；5 h时转化率约为75％,但(R)-酮基布洛芬e.e.％降至18.16％。
　　 在重组菌湿菌体转化体系,该酶在1 h至9 h时转化率从10％增至50％,而(R)-酮基布洛芬的e.e.％一直保持在73％-76％之间。
　　 两组的实验结果表明:NK13新发现的酯酶为(R)-酮基布洛芬专一性酶；转化的反应体系对酶的立体选择专一性有一定影响。
　　 NK13号菌中741 bp基因所编码的246个氨基酸残基的酯酶是在NK13号菌中发现的第三个水解酶。该酶能够优先转化获得(R)-酮基布洛芬的结果,进一步证明了野生菌中存在不同具有不对称拆分能力的水解酶是影响产物光学纯度的重要因素之一。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 前言

第一节 手性药物概述

1.1.1 手性

1.1.2 手性药物

1.1.3 单一对映体手性药物的开发

1.1.4 单一对映体手性药物的制备方法

1.1.5 手性药物的研究意义

第二节 2-芳基丙酸类药物

1.2.1 2-芳基丙酸类药物

1.2.2 酮基布洛芬

第三节 酯酶和脂肪酶概述

1.3.1 酯酶和脂肪酶

1.3.2 酯酶/脂肪酶的三维结构和催化机理

1.3.3 酯酶和脂肪酶的克隆表达

第四节 研究目的与意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 载体质粒

2.1.3 材料和试剂

2.1.4 实验仪器

第二节 实验方法

2.2.1 培养基和培养条件

2.2.2 NK13基因文库的构建

2.2.3 酯酶基因的克隆及表达

2.2.4 酯酶的活性检测

2.2.5 SDS-PAGE检测酯酶的蛋白分子量

2.2.6 重组表达菌株转化酮基布洛芬氯乙酯

第三章 实验结果

第一节 NK13基因文库的构建和目的基因的筛选

3.1 I 1 NK13菌株基因组DNA的提取

3.1.2 Sau3AI部分酶切基因组DNA

3.1.3 pUC18载体的制备和体外连接

3.1.4 电转化

3.1.5 含酯酶基因转化子的筛选和验证

3.1.6 酯酶基因转化子的测序结果

第二节 酯酶基因的克隆与表达

3.2.1 酯酶基因的扩增

3.2.2 表达载体的构建

3.2.3 酯酶基因酶活力的测定

3.2.4 SDS-PAGE检测酯酶蛋白的表达

第三节 酯酶手性拆分酮基布洛芬氯乙酯

3.3.1 重组菌发酵液对酮基布洛芬氯乙酯的手性拆分

3.3.2 重组菌湿菌体对酮基布洛芬氯乙酯的手性拆分

第四章 讨论

第一节 基因文库的构建

4.1.1 基因文库构建的要求

4.1.2 限制性内切酶的选取

4.1.3 电转化

4.14 转化子的筛选

第二节 NK13号菌中酯酶基因的生物学信息分析

第三节 NK13号菌中酯酶对酮基布洛芬氯乙酯的转化

第四节 工作展望

第五章 结论

参考文献

致谢

附录1 pUC-NK-741EST测序结果

附录2 外源片段拼接结果

附录3 NK13菌中741bp酯酶基因的分析

附录4 NK13菌中933bp酯酶基因的分析

附录5 NK13菌中633bp脂肪酶基因的分析

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果