红色亚栖热菌CBS-01海藻糖合酶定向进化方法的建立及高酶活突变体的筛选

摘要

海藻糖(Trehalose)是一种重要的非还原性二糖，广泛存在于生物体内。在海藻糖的工业生产中，酶催化法因其工艺简单、成本低、转化率高等优点，已经成为重要的生产方法。红色亚栖热菌(Meiothermus rubber)CBS-01海藻糖合酶(Trehalose synthase，M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应，且具有很好的热稳定性及pH耐受性，是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高M-TreS的酶学性能，使其能够满足工业生产的要求，有必要建立一种有效的定向进化方法对其进行改造。
　　 海藻糖合酶M-TreS的基因全长2889bp，是一个相对较大的DNA分子。在几种常见的定向进化方法中，易错PCR能够随机的在该基因中引入点突变。而全长基因的DNA shuffling或者错列延伸法(the staggered extension process，StEP)法则不适于这种大分子的改造。为了加快M-TreS的进化速度，本实验将M-TreS的基因分成两个小片段进行改造，建立了分段DNA shuffling和分段StEP两种分段进化方法。分段进化的步骤大体为亲本分段、分段进化、完整基因突变群的组装及建立突变文库四个步骤。也就是说，分段定向进化巧妙的将大基因重组转变成小片段重组。实验表明，这种方法不但可操作性和可重复性都优于全长基因的shuffiing和StEP，而且能够加强M-TreS的进化强度。
　　 本文建立了该酶的易错PCR、分段DNA shuffiing和分段StEP相结合的定向进化方法。几种方法的比较表明，易错PCR法产生的突变体中具有海藻糖合酶活性的突变体所占的比例较高，正向突变率高，但是变异的幅度较低，需要高灵敏度的筛选方法；分段DNA shuffling，致死突变率高，变异幅度较大，正向突变率较易错PCR低，比较适合目前的筛菌策略。而分段StEP，负向突变率较高，欲获得正向突变株需要构建较大的突变文库。所以，易错PCR与分段DNAshuffling的结合使用成为本文对M-TreS进化的主要策略，分段StEP可以作为辅助手段。
　　 本文通过易错PCR和分段DNA shuffiing结合获得一株催化活性是野生型1.6倍，催化效率是野生型2倍的突变株。序列分析表明，该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代，其中一个来自易错突变，2个来自同源重组，其他三个为随机自发突变。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

第一节 海藻糖概述

1.1.1 海藻糖的结构

1.1.2 海藻糖的功能

1.1.3 海藻糖的应用

1.1.4 海藻糖的代谢

第二节 海藻糖合酶的研究进展和结构特性

1.2.1 海藻糖合酶的研究进展

1.2.2 海藻糖合酶的结构和催化机制

1.2.3 嗜热菌海藻糖合酶的结构特征

第三节 定向进化技术的概况

1.3.1 蛋白质的适应度景观学说概述

1.3.2 定向进化的基本思路

1.3.3 几种常用的分子定向进化原理

1.3.4 定向进化分子策略

1.3.5 共进化

第四节 选题背景和技术路线

1.4.1 选题背景

1.4.2 技术路线

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料

2.1.1 菌株、质粒及引物

2.1.2 酶及试剂

2.1.3 主要仪器

第二节 实验方法

2.2.1 试剂配置

2.2.2 培养基的配置

2.2.3 CaCl2法制备大肠杆菌感受态

2.2.4 易错PCR方法的建立

2.2.5 M-tres DNA shuffling方法建立

2.2.6 M-treS StEP方法建立

2.2.7 活性突变体TreS的初步筛选

2.2.8 粗酶液中海藻糖合酶活力单位数的测定

2.2.9 海藻糖合酶的纯化

2.2.10 SDS-PAGE检测海藻糖合酶分子量

2.2.11 海藻糖合酶的酶活测定

2.2.12 海藻糖合酶动力学常数的测定

2.2.13 海藻糖合酶热稳定性的测定

2.2.14 序列及三维模型分析

第三章 结果与讨论

第一节 M-TreS易错PCR方法结果

3.1.1 易错PCR分子方法验证结果

3.1.2 M9突变体酶学性质检测

第二节 M-TreS DNA SHUFFLING方法的建立

3.2.1 M-treS全长DNA shuffling条件摸索结果

3.2.2 M-treS分段DNA shuffling方法的建立

第三节 M-TreS分段StEP方法的建立

3.5.1 M-treS全长StEP条件摸索

3.5.2 t.St-1.7和t.St-1.2分段StEP及搭桥结果的电泳验证

第四节 易错PCR、分段DNA shuffling及分段StEP三种定性进化方法活性保存率及正负向突变率分析

第五节 讨论

3.7.1 海藻糖合酶改造取得的成绩及M-TreS进化方法的探索

3.7.2 易错PCR与分段定向进化方法结合的优势

3.7.3 M-TreS改造中存在的问题及解决策略

3.7.4 展望

第四章 结论

参考文献

致谢

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果