LXR配体与MEK1/2抑制剂组合药物防治动脉粥样硬化的作用与机理研究

摘要

巨噬细胞泡沫化、内皮损伤和高甘油三酯血症是动脉粥样硬化发生与发展中的重要过程。巨噬细胞ATP结合盒转运体A1(ABCA1)介导胆固醇外流、促进HDL形成，从而刺激胆固醇逆向转运(RCT)、抑制泡沫细胞形成与动脉粥样硬化发展。此外，抑制巨噬细胞对胞外胆固醇的摄取也能降低其泡沫化水平，从而抑制动脉粥样硬化的发展。白细胞介素5(IL-5)刺激B-1细胞表达、分泌具有结合氧化态LDL(ox-LDL)能力的T15/EO6 IgM抗体，从而阻止巨噬细胞泡沫化、抑制动脉粥样硬化发展。反之，巨噬细胞IL-5表达缺失加速动脉粥样硬化的发展。内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的起始因素，miR-126通过抑制RGS16来激活CXCLS12/CXCR4信号通路、促进内皮修复、降低VCAM-1表达，从而对动脉起保护作用。配体激活的转录因子肝X受体(LXR)刺激ABCA1的表达，但同时刺激脂肪酸合成、引起严重脂肪肝和高甘油三酯血症等。我们前期成果表明促分裂原活化蛋白激酶激酶1和2(MEK1/2)抑制剂协同LXR配体诱导ABCA1表达与胆固醇流出。同时，文献表明ERK1敲除小鼠肥胖症得到改善，脂肪组织炎症水平下降，基础代谢水平升高，预示着MEK1/2抑制剂能够抑制脂质生成，从而消除LXR配体引起的副作用。因此我们认为有必要研究LXR配体与MER1/2抑制剂组合能否将以协同效应抑制动脉粥样硬化的发生、促进已发展的斑块消退，同时MEK1/2抑制剂能否消除LXR配体诱导的副作用，并深入研究相关机理。在本研究中，我们发现MEK1/2抑制剂(U0126)和LXR配体(T0901317)单独或组合喂食载脂蛋白E基因缺陷（Apoe-/-）小鼠，U0126与T0901317协同性地抑制动脉粥样硬化的发生，促进已发展的斑块消退，但完全阻断了T0901317引起的高甘油三酯血症和脂肪肝副作用的出现。机理上，我们发现组合药物协同性地激活巨噬细胞ABCA1表达和体内RCT、抑制泡沫细胞的形成和巨噬细胞在主动脉根部的堆积;组合药物激活内皮细胞和平滑肌细胞miR-126的表达，从而降低RGS16和VCAM-1的表达，同时增加CXCL12和CXCR4在主动脉根部的表达。此外，在免疫方面我们发现LXR配体诱导巨噬细胞IL-5蛋白的表达和分泌，促进血浆中IL-5和总IgM水平的上升、IL-5在主动脉根部区域的表达;U0126单独或与T0901317组合使用时抑制甘油三酯(TG)合成相关基因的表达，刺激TG水解和游离脂肪酸氧化相关基因的表达，从而阻断高甘油三酯血症和脂肪肝等副作用。总之，我们的研究表明，MEK1/2抑制剂和LXR配体组合药物通过增加ABCA1表达和RCT，促进内皮修复相关基因表达，阻止高甘油三酯血症等功能显著地发挥抗动脉粥样硬化作用，可能是动脉粥样硬化防治新颖的疗法。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 引言

第一节 动脉粥样硬化发展现状

1．1．1 动脉粥样硬化国内外发病形势及形成机制

1．1．2 治疗动脉粥样硬化药物发展现状

第二节 动脉粥样硬化与炎症反应

1．2．1 血管内皮下巨噬细胞参与的炎症反应

1．2．2 T细胞、B细胞参与的炎症反应与血栓形成

1．2．3 脂代谢在动脉粥样硬化过程中的作用及其相关的炎症反应

第三节 LXR与ERK1／2信号通路与动脉粥样硬化

1．3．1 LXR信号通路概述

1．3．2 LXR信号通路与动脉粥样硬化

1．3．3 ERK1／2信号通路概述

1．3．4 MEK1／2抑制剂与动脉粥样硬化和脂质代谢的关系

第四节 microRNA与动脉粥样硬化

1．4．1 mircoRNA在心血管疾病中的作用

1．4．2 miR-126与动脉粥样硬化

第五节 甘油三酯代谢与高甘油三酯血症

1．5．1 甘油三酯的合成

1．5．2 甘油三酯的水解与自由脂肪酸β-氧化

1．5．3 高甘油三酯血症

第六节 选题依据

第二章 实验材料与方法

第一节 实验材料、试剂及主要仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验仪器

第二节 实验方法

2．2．1 实验动物的饲养

2．2．2 组织获取

2．2．3 细胞培养及处理

2．2．4 油红O染色

2．2．5 主动脉剥离

2．2．6 石蜡切片

2．2．7 冰冻切片

2．2．8 免疫组化染色

2．2．9 免疫荧光

2．2．10 细胞及组织蛋白提取与Western blot

2．2．11 细胞及组织RNA提取与real time RT-PCR

2．2．12 miR-126表达水平检测

2．2．13 流式细胞分选技术分离脾脏和淋巴结T细胞

2．2．14 酶联免疫吸附测定(Elisa)

2．2．15 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)

2．2．16 双荧光报告基因系统

2．2．17 基因克隆与细胞转染

2．2．18 胆固醇体内反向转运(RCT)

2．2．19 血脂成分分析

2．2．20 肝脏甘油三酯含量的测定

2．2．21 数据统计分析

第三章 实验结果

第一节 MEK1／2抑制剂防止LXR配体引起的脂肪肝、高甘油三酯血脂和肝损伤等副作用

3．1．1 MEK1／2抑制剂下调LXR配体引起的肝损伤

3．1．2 MEK1／2抑制剂消除高脂食物与LXR配体所诱导的高甘油三酯血症

3．1．3 MEK1／2抑制剂消除高脂食物与LXR配体所诱导的脂肪肝

第二节 组合药物预防动脉粥样硬化的发生并避免副作用的产生

3．2．1 MEK1／2抑制剂协同LXR配体抑制主动脉粥样硬化斑块的发生

3．2．2 组合药物消除高脂食物与LXR配体引起的Apoe-／-小鼠肝损伤、脂肪肝和高甘油三脂血症等副作用

第三节 组合药物治疗动脉粥样硬化、促进斑块消退

3．3．1 组合药物治疗动脉粥样硬化斑块

3．3．2 组合药物避免治疗组小鼠脂肪肝副作用的产生

第四节 组合药物预防动脉粥样硬化发生发展、刺激成熟斑块消退的分子机制研究

3．4．1 组合药物降低血清总胆固醇水平

3．4．2 甘油三酯水平升高促进动脉粥样硬化的发生发展

3．4．3 组合药物协同抑制泡沫细胞生成

3．4．4 组合药物协同刺激巨噬细胞ABCA1的表达

3．4．5 组合药物协同刺激小鼠体内胆固醇逆转运

3．4．6 LXR配体促进体内IL-5表达分泌和特异性抗ox-LDL抗体-IgM的产生

3．4．7 MEK1／2抑制剂刺激肝脏PSCK9和LDLR的表达

3．4．8 组合药物通过miR-126调控内皮功能，抑制单核细胞粘附，促进内皮修复

第五节 MEK1／2抑制剂消除LXR配体副作用的分子机理研究

3．5．1 MEK1／2抑制剂不影响LXR配体诱导的自由脂肪酸合成

3．5．2 MEK1／2抑制剂和LXR配体组合药物抑制肝脏甘油三酯合成

3．5．3 组合药物促进肝脏甘油三酯水解

3．5．4 组合药物促进肝脏自由脂肪酸β-氧化

第四章 讨论

第一节 动脉粥样硬化防治药物现状

第二节 组合药物防治动脉粥样硬化的分子机制

4．2．1 组合药物降低小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇水平

4．2．2 LxR配体刺激巨噬细胞IL-5表达

4．2．3 组合药物刺激胆固醇逆转运

4．2．4 组合药物消除LXR配体引发的高甘油三酯血症对动脉粥样硬化的促进作用

4．2．5 组合药物剌激microRNA-126表达

第三节 MEK1／2抑制剂避免LXR配体引起的脂肪肝和高甘油三酯血症副作用的分子机制

4．3．1 MEK1／2抑制剂不影响LXR配体诱导的自由脂肪酸合成

4．3．2 ERK1／2信号通路在脂质代谢平衡中的作用

第四节 组合药物在疾病治疗中的应用与展望

第五章 结论

第一节 课题结果概述

第二节 论文创新

第三节 进一步需要做的工作

参考文献

致谢

个人简历