XIAP蛋白UBA和BIR2结构域的核磁共振研究

摘要

X-染色体相关的凋亡抑制蛋白(XIAP)，是IAP家族中最有效的Caspase抑制剂，全长有497个氨基酸，分子量约57 kDa，包括3个BIR结构域、一个RING结构域和一个UBA结构域。BIR结构域是一个大约有70个氨基酸残基并且有一个锌指结构片段，位于XIAP蛋白的N端。BIR1结构域可以激活下游TAK1信号途径；BIR2/BIR3结构域可以有效地结合并抑制caspase-3、caspase-7及caspase-9的活性。碳末端RING结构域可以作为泛素连接酶E3酶，能够介导XIAP自身以及与它相互作用的蛋白分子泛素化，以抑制细胞的凋亡。XIAP的UBA结构域相对BIR结构域和RING结构域被发现的相对晚一些，研究的也少。UBA位于BIR3结构域与RING结构域之间，约有80个氨基酸残基，并能够与Ubiqutin相互作用。Ubiqutin除经典界面残基发生化学位移以外，还有尾端残基。尾端残基是否与UBA结合还不清楚。本论文在第二章通过高分辨核磁共振技术，详细的探究了野生型Ubiquti以及尾端切掉后Ubiqutin与UBA结合状态，测定了结界面上的残基以及结合常数，发现尾端切掉后Ubiqutin与UBA结合力变弱，说明尾端在结合中起重要的作用。
　　本文为探究XIAP与铜的作用机制，截取XIAP的BIR2结构域作为研究对象，对BIR2野生型及突变体的表达与纯化进行了探索，并获得了15N同位素标记稳定的可溶蛋白，利用高分辨核磁共振得到了野生型及突变体的2D1H-15N HSQC谱图，为下一步利用高分辨核磁共振，探究单独BIR2结构域与铜离子的结合机制打下基础。

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第一章 引言

第一节 细胞凋亡与凋亡蛋白介绍

1.1.1 细胞凋亡

1.1.2 凋亡蛋白Caspase家族

第二节 抑制凋亡蛋白家族（IAPs）介绍

1.2.1 人体凋亡抑制蛋白（IAPs）

1.2.2 人体凋亡抑制蛋白（IAPs）在细胞凋亡中的调节作用

第三节 抑制凋亡蛋白XIAP背景介绍

1.3.1 XIAP蛋白的组成

1.3.2 XIAP-BIR1结构域的研究

1.3.3 XIAP-BIR2结构域的研究

1.3.4 XIAP-BIR3结构域的研究

1.3.5 XIAP-UBA结构域的研究

1.3.6 XIAP-RING结构域的研究

1.3.7 XIAP在铜代谢机制中的调节作用

第二章 XIAP-UBA的表达纯化与核磁研究

第一节 实验材料

2.1.1 研究对象

2.1.2 试剂与仪器

2.1.3 基本的实验流程和常用溶液的配置

第二节 UBA的表达纯化条件筛选

2.2.1 UBA蛋白表达与纯化

2.2.2 UBA蛋白表达条件进行筛选

2.2.3 UBA蛋白表达条件确定

第三节 UBA结构域与泛素蛋白Ubiqutin相互作用的研究

2.3.1 研究方法与背景

2.3.2 化学位移扰动法研究Ubiqutin与UBA的相互作用

2.3.3 顺磁标记法研究Ubiqutin与UBA的相互作用

第四节 小结

第三章 抑制细胞凋亡蛋白XIAP-BIR2的表达纯化

第一节 长链XIAP-BIR2 (124-240)表达纯化

3.1.1 实验室目的基因的获得：

3.1.2 长链XIAP-BIR2 (124-240)表达纯化条件筛选

3.1.3 长链XIAP-BIR2 (C213G/C202A)突变体表达、纯化条件的筛选

3.1.4 实验小结

第二节 截短的XIAP-BIR2 (152-236)表达纯化

3.2.1 实验室目的基因的获得

3.2.2 截短的野生型XIAP-BIR2 (152-236)蛋白表达、纯化条件的筛选

3.2.3 截短的XIAP-BIR2 (152-236) C202A突变体表达、纯化条件的筛选

3.2.4 截短的XIAP-BIR2 (C213S)突变体表达、纯化条件的筛选

3.2.5截短的XIAP-BIR2 (C202A/C213S)突变体表达、纯化条件的筛选

第三节 小结

第四章 T4溶菌酶蛋白的表达纯化

第一节 质粒的获取

4.1.1 T4溶菌酶（T4lysozyme）野生型及突变体质粒的获取

第二节 溶菌酶（T4lysozyme）野生型及突变体表达纯化

4.2.1 T4lysozyme C54T/C97 (T4-WT)表达条件的筛选

4.2.2 T4lysozymeC54T/C97各突变体纯化过程及蛋白产量

4.2.3 T4lysozyme C54T/C97各突变体核磁谱图采集

第三节 小结

参考文献

第五章 总结与展望

致谢

个人简历及在校获奖