UBXD2蛋白UBX结构域的结构与功能研究和核磁共振方法研究树枝形分子与生物表面活性剂相互作用及基于树枝形分子的药物筛选

摘要

本论文的工作重点包括两部分的内容：第一部分是人的UBXD2蛋白UBX结构域的克隆，表达和纯化，并用液体核磁共振的方法解析了UBXD2 UBX结构域的溶液结构，并初步研究了UBXD2蛋白质和VCP蛋白质的相互作用。在结构解析过程中，我们发现了UBXD2 UBX结构域上位于与VCP VCP-N结构域蛋白相互作用的关键区域的一个脯氨酸处于顺式构象。第二部分是核磁共振方法研究树枝形分子与具有生物活性的表面活性剂的相互作用和基于树枝形分子的药物筛选。
　　 第一章是关于人的UBXD2蛋白质的UBX结构域的结构和功能的研究。这一章的第一部分是对UBXD2蛋白质以及UBX结构域的研究进展的一个综述。UBXD2蛋白质，又名erasin，最初是被发现参与细胞内质网蛋白质降解(ERAD)过程有关的蛋白。研究发现，UBXD2蛋白质是通过自身含有的UBX结构域和VCP蛋白质N端结构域VCP-N发生相互作用参与这个过程。UBXD2蛋白质因包含UBX结构域而得名，而且UBX结构域是UBXD2上唯一的一个结构域。研究发现，UBX结构域上含有高度保守的R…FPR的折叠花样。这个折叠花样是结合的关键部位，也是UBX结构域和泛素蛋白质或者含有泛素结构域蛋白结构上最大不同的地方。这一章第二部分和第三部分，我们克隆、表达了UBXD2 UBX结构域，并利用传统的核磁共振实验方法测定并解析了它的溶液结构。根据解析获得的结构，UBXD2 UBX结构域的空间结构由2段α螺旋和4段β折叠组成，并且有一段和发挥功能密切相关的loop区。2段α螺旋和4段β折叠之间的疏水残基形成了一个疏水核心来维持和稳定蛋白质的稳定。通过同源序列比对发现，与发挥功能密切相关的loop区是保守的，而且里面有一个FP motif对结合至关重要。在解析的过程中，我们意外地发现UBXD2 UBX结构域含有的6个脯氨酸中，有两个处于顺式构象。其中一个正好位于结合的关键位点FP motif。通过用化学位移干扰实验，我们测定了UBXD2 UBX结构域和VCP VCP-N结构域的相互作用，并初步验证了这两者的相互作用比较弱，属于一种常见的快交换。鉴于UBX结构域蛋白质是一类三级结构比较保守的蛋白质，我们借用生物信息学手段，从蛋白质数据库中已有的UBX结构域p47 UBX和VCPVCP-ND1蛋白的复合物晶体结构出发，用计算机的方法模拟了UBXD2 UBX结构域和VCPVCP-N结构域的复合物结构，为解释体内UBXD2蛋白和VCP蛋白相互作用引起内质网蛋白质降解提供结构生物学基础。
　　 第二章的工作是使用核磁共振方法研究树枝形分子与具有生物活性的表面活性剂分子的相互作用和基于树枝形分子的药物筛选。这一章的第一部分，首先，我们对常用于化学生物学相关的核磁共振方法包括一维核磁共振谱、二维核磁共振谱，扩散谱等等做了一个介绍，分别描述了各种不同的核磁共振方法的原理和应用，可以深入研究和表征功能高分子和化学小分子之间的相互作用细节，可以提供结合位点、结合强度、结合作用力的类型和结合之后的空间定位或取向等等非常有用的信息。然后，我们对树枝形分子(dendrimer)这种功能化的高分子材料做了简单介绍，包括树枝形分子的历史、合成，物理化学性质以及应用等等。接着，我们介绍基于树枝形分子和化合物小分子相互作用的主—客体系统研究的内容，并且以胆酸为代表介绍了树枝形分子和具有生物活性的表面活性剂的相互作用研究是主—客体系统研究中的非常重要的一部分。研究树枝形分子—胆酸的聚集体的结构特性和相互作用对于了解树枝形分子在生理体内的代谢有很重要的意义，同时为开发树枝形分子的临床应用研究做好铺垫。最后我们介绍了药物筛选和高通量药物筛选的内容，并介绍了基于树枝形分子相互作用的高通量药物筛选的内容和意义。这一章的第二和第三部分，我们用核磁共振研究了树枝形分子和具有生物活性的表面活性剂脱氧胆酸的相互作用形成树枝形分子和脱氧胆酸复合物，发现脱氧胆酸分子只定位在树枝形分子的疏水口袋而不结合在表面，从而说明了树枝形分子和脱氧胆酸的结合是因为它们之间的疏水相互作用和氢键相互作用。通过2D-NOESY谱，我们得到了脱氧胆酸分子在树枝形分子内部疏水空腔中的定位信息。通过对比树枝形分子和胆酸类似分子CHAPS的相互作用研究结果，我们还发现了树枝形分子对脱氧胆酸分子的包裹是一个跟客体分子尺寸有关过程。随后，在研究树枝形分子和脱氧胆酸、CHAPS的相互作用基础上，我们利用常规的和新的核磁共振技术研究基于树枝形分子结合的药物的筛选，并设计了不同的方案应对树枝形分子—不溶药物和树枝形分子—可溶药物两种体系的高通量筛选并进行了尝试，提出一套基于树枝形分子相互作用的高通量药物筛选的核磁共振方法。基于Hadamard的快速实验可以进一步减小核磁共振实验时间，提高高通量筛选的效率。Hadamard快速实验可以在提供相同的实验信息的基础上可以把核磁共振的实验时间从整天减小到几分钟。这一点是高通量筛选所必需的。同时，由于Hadamard快速实验需要的时间很短，因此我们可以适当地延长实验时间获得更高的信噪比。这一套方法对于大规模地发现和筛选各种和树枝形分子相互作用的化合物小分子具有重要的意义。同时，这种高通量筛选的方法还可以设计和优化基于树枝形分子相互作用药物分子的构型。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 UBXD2 UBX结构域的溶液结构和功能研究

第一部分综述

1.1 UBXD2蛋白的简介

1.2 UBX结构域的来源和UBX结构域蛋白的分类

1.3 UBX结构特点以及与VCP蛋白的相互作用概述

1.4总结

第二部分材料和方法

2.1 UBXD2的UBX结构域的克隆、表达和纯化

2.2 NMR实验与数据变换

2.3 UBX结构域主链顺序认证及侧链化学位移归属方法

2.4结构计算

2.5化学位移干扰实验

2.6计算机模拟UBXD2 UBX结构域和VCP VCP-N结构域复合物结构

第三部分结果和讨论

3.1 UBXD2 UBX结构域的化学位移认证

3.2结构计算

3.3 UBXD2 UBX结构域中存在顺式脯氨酸

3.4 UBXD2 UBX结构与和与其他的UBX结构域的结构比较

3.5 UBXD2 UBX结构域与VCP VCP-N结构域相互作用研究

3.6 UBX结构域和VCP-N结构域复合物结构的计算机模拟

3.7总结

参考文献

第二章 核磁共振方法研究树枝形分子与药物分子相互作用和基于树枝形分子的药物筛选

第一部分综述

1.1 核磁共振技术简述及在树枝形分子研究中的应用

1.2树枝形纳米分子概述

1.3树枝形分子与药物分子相互作用概述

1.4基于树枝形分子相互作用药物筛选的概述

1.5总结

第二部分实验材料和实验方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

第三部分结果和讨论

3.1 树枝形分子与胆酸相互作用研究

3.2基于树枝形分子的高通量筛选

3.3总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果