一种新的短小芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离、纯化及酶学性质研究

摘要

本研究从皮革厂、畜肉市场和屠宰场等处采样，分离得到49株具有明胶水解活性的微生物。菌株Col-C的培养液能在48h内对犊牛皮有明显消化作用，菌株Col-J则能完全消化。经形态学观察、生理生化培养和16SrDNA序列分析，鉴定菌株Col-C为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescen)，菌株Col-J为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)。以Ⅲ型酸性胶原蛋白为底物，菌株Col-C和菌株Col-J的胶原蛋白酶活性分别为21.19U/mL和35.97U/mL。菌株Col-J培养液的活性凝胶电泳实验表明：该菌至少产生了3种具有胶原蛋白酶活性的同工酶。 以短小芽孢杆菌Col-J为材料，进行了胶原蛋白酶的分离纯化。发酵液离心去菌体，上清分别采用30％饱和度和75％饱和度的硫酸铵分级沉淀，沉淀溶解后，透析脱盐、浓缩。将样品过SephadexG-100分子筛层析柱，收集活性峰S1。然后用过SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱，收集活性峰Q3。SDS-PAGE检测表明：得到的电泳纯胶原蛋白酶，分子量约为58.64kD。结果表明：本实验对胶原蛋白酶的纯化倍数为31.53，回收率为7.00％。 对纯化后的胶原蛋白酶进行酶学性质研究。结果表明：该酶的最适反应温度为45℃，最适反应pH值为7.5。具有较强的耐热性，经30℃-65℃处理5min后仍能相对稳定，可保持在最高酶活的60％以上。经pH6-pH8.5的缓冲液处理30min后相对稳定，能保持在最高酶活的60％以上。离子影响实验表明：50mmol/L的Li+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和Ba2+对胶原蛋白酶具有一定的激活作用，而50mmol/L的Na+、Mn2+、Fe3+和pb2+，以及0.01mmol/L的EDTA、EGTA和巯基乙醇则能抑制胶原蛋白酶的酶活。其中，Ca2+对酶的激活作用最强，相对酶活达到127％；而EGTA对酶的抑制作用最为强烈，相对酶活仅为10.1％。底物特异性实验表明，该酶对Ⅲ型酸性胶原蛋白具有较高的专一性。在pH7.5，45℃条件下，该胶原蛋白酶对酸性可溶胶原蛋白Ⅲ的米氏常数Km为0.79mg/mL，最大反应速度Vmax为0.1295mg/(min·mL)。与已有报道的胶原蛋白酶性质比较表明：从短小芽孢杆菌Col-J分离纯化的该酶是一种新的胶原蛋白酶。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1胶原蛋白酶产生菌的来源

2胶原蛋白酶酶活测定方法

3胶原蛋白酶的纯化及酶学性质

4胶原蛋白酶的应用

5问题与展望

6本研究的目和意义

第二章产胶原蛋白酶细菌的分离与鉴定

1材料

2方法

2.1菌种的筛选

2.2菌种的鉴定

2.3酶活的测定

3结果

3.1胶原蛋白酶产生菌的分离与筛选

3.2牛皮消化试验

3.3细菌鉴定

3.4胶原蛋白酶活力测定

3.5明胶活性聚丙烯酰胺凝胶电泳

4讨论

4.1胶原蛋白酶产生菌的筛选

4.2细菌鉴定

第三章芽孢杆菌胶原蛋白酶的分离纯化

1材料

2方法

3结果

3.1硫酸铵最适饱和度的确定与分级沉淀

3.2 Sephadex G-100凝胶层析

3.3 Q Sepharose Fast Flow阴离子交换

3.4 SDS-PAGE

3.5纯化效果评价

4.讨论

4.1蛋白质分离纯化方法的选择

4.2纯化过程的影响

第四章芽孢杆菌胶原蛋白酶酶学性质的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

3.1温度及pH对胶原蛋白酶活性的影响

3.2金属离子及还原剂对胶原蛋白酶活性的影响

3.3底物特异性

3.4 Km

小 结

参考文献

致谢